Andamio con base de fibrina, preparación y uso del mismo.

Un andamio con base de fibrina capaz de mantener una población de células introducidas en el andamio que comprende una concentración inicial de células de al menos 1 x 106 células/ml andamio de células madre mesenquimales (CMM) y/o células derivadas de tejido del cordón umbilical (CTU) donde el andamio se forma con un componente de fibrinógeno que comprende fibrinógeno con una concentración final superior a 17,

5 mg/ml andamio, comprendiendo el andamio CTU, CMM introducidas o una combinación de las mismas en un rango de concentración inicial de 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio, donde el andamio de fibrina está sustancialmente libre de inhibidores de proteasa añadidos, y donde el andamio que comprende CMM y/o CTU introducidas es para uso en el aumento de vascularización.

Andamio con base de fibrina, preparación y uso del mismo Campo de la invención La invención se refiere a un andamio con base de fibrina adecuado para terapia celular

Antecedentes de la invención En los últimos años se han desarrollado numerosas terapias utilizando una variedad de células madre, que son el elemento clave de una nueva especialidad emergente llamada medicina regenerativa. La medicina regenerativa tiene el potencial de emplear células madre de fuentes de embriones o de adultos para proporcionar terapias celulares de sustitución en condiciones genéticas, malignas y degenerativas.

Los estudios relacionados con la medicina regenerativa se han desarrollado en dos direcciones principales: estudios dirigidos hacia la regeneración de células o tejidos usando administración exógena de factores biológicos o químicos tales como factores del crecimiento para inducir regeneración endógena de un tejido o un órgano entero dañado (por ejemplo, uso de administración de FCEV para la inducción de nuevos vasos sanguíneos) ; y estudios sobre la reposición de tejido u órganos enteros dañados mediante células exógenas y trasplante de células madre (tales como trasplante de médula ósea) , incluyendo células sembradas en varios andamios que mejoran el injerto de las células in vivo, la curación de heridas, y la reparación de la piel u órganos dañados por operaciones quirúrgicas (Hunt NC, Grover LM. Biotechnol Lett. 2010 Junio; 32 (6) :733-42; Spotniz WD. World J Surg. 2010 Abr; 34 (4) :632-4) . En medicina regenerative, las “células” y el “andamio” se usan en combinación para la regeneración de un tejido. Típicamente, los materiales del andamio tienen dos características; son biocompatibles, por lo que los materiales no dañan un cuerpo vivo, y son bioabsorbibles, por lo que los materiales se descomponen y absorb3en en el cuerpo vivo cuando se forman nuevos tejidos vivos (Uibo R, LaidmÃe I, Sawyer ES, Flanagan LA, Georges PC, Winer JP, Janmey PA. Biochim Biophys Acta. 2009 Mayo; 1793 (5) :924-30) . Algunos materiales biológicos tienen ambas características y pueden usarse como andamio en regeneración de tejidos (Chajra H, Rousseau CF, Cortial D, RonziÃre MC, Herbage D, Mallein-Gerein F, Freyria AM. Biomed Mater Eng. 2008; 18 (1 Supl) :S33-45) .

Durante la inyección o trasplante de célula se pueden restauran de manera eficiente áreas de daños, pero se requiere la reconstrucción del daño severo del tejido dañado, por ejemplo el daño resultante de bloqueo vascular, una terapia extensiva con numerosas células endoteliales. La eficiencia de la terapia celular puede mejorar manteniendo células endoteliales en un sitio objetivo durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo. Se han presentado estudios sobre la retención de células dentro de marcos musculares que indican un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo de 4 días o más (Peirce SM, Skalak TC Microcirculation. 2003 Enero; 10 (1) :99111) .

Timothy P. Martens, et al., Cell Transplant. 2009; 18 (3) 297-304; Nakamuta JS et al., PloS One. 2009 Junio 23; 4 (6) :e6005, Christmas KL et al., J Am Coll Cardiol. 2004 Agosto 4; 44 (3) :654-60, y otros probaron que la implantación de células directamente en el músculo es ineficiente. Estos estudios demostraron que las células implantadas rápidamente se despejan del sitio de implantación o mueren aproximadamente 24 horas después de la implantación. Típicamente, las células usadas para implantación son células madre capaces de liberar factores de crecimiento/citoquinas beneficiosos. Sin embargo, en vista de lo anterior, la inyección de células directamente en el sitio de implantación no pueden permitir la liberación de factores de crecimiento y citoquinas en el sitio del implante durante un periodo prolongado de tiempo. Estos estudios también demostraron que la administración de células introducidas en polímeros de varios tipos puede ayudar en gran medida a retener las células en el sitio de implantación.

El despeje rápido de las células del sitio de implantación y/o muerte de las células puede atribuirse a uno o más de los siguientes factores: flujo sanguíneo o fluidos corporales que eliminan las células del sitio de implantación, escasez de nutrientes tales como factores de crecimiento, pH inadecuado, falta de oxígeno en el área herida, reacción inmune innata (complemento) y actividad de fagocitos del sistema inmune (Guo S, Dipietro, LA J Dent Res. 2010 Marzo; 89 (3) :219-29) . El despeje rápido de células inyectadas estimuló el desarrollo de un andamio adecuado que puede fijar las células al sitio de inyección y mantener la viabilidad de las células durante los primeros días para que las células puedan efectuar su efecto trófico en el área isquémica, entre otros, liberando niveles beneficiosos de factores de crecimiento/citoquinas durante un periodo prolongado de tiempo. Cuando el área herida se cura y el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) está en proceso, un proceso que tarda de unos días a 2 semanas (Guo S, Dipietro LA J Dent Res. 2010 Marzo; 89 (3) :219-29) , la habilidad de las células para liberar citoquinas de una manera prolongada localmente, por ejemplo, en el sitio de isquemia, es importante para una curación eficiente (Guo S, Dipietro LA J Dent Res. 2010 Marzo; 89 (3) :219-29) .

Se han usado varios materiales biológicos como andamios celulares para implantación de células. Entre estos materiales están colágeno, gelatina, elastina, ácido hialurónico, alginato, quitosano y fibrina (Hunt NC, Grover LM Biotechnol Lett. 2010 Junio; 32 (6) :733-42) .

El material de andamio que sostiene las células de manera ventajosa cumple varios criterios importantes.

Por ejemplo, el material es biocompatible, para no ser tóxico ni perjudicial, y no causar rechazo inmunológico. También, el material es biodegradable. De manera importante, el andamio tiene la habilidad de soportar, durante un periodo suficiente de tiempo, su degradación dentro del medio corporal. Por ejemplo, un periodo suficiente de tiempo es un tiempo que permite que las células dentro del andamio ejerzan una liberación prolongada y local de factores de crecimiento/citoquinas. El fibrinógeno es una proteína soluble encontrada en el plasma sanguíneo de todos los vertebrados. Cuando el fibrinógeno y el Factor XIII contactan mediante trombina, una enzima proteolítica, el fibrinógeno se convierte en monómeros de fibrina y el Factor XIII se activa con el Factor XIIIa. El Factor XIIIa después polimeriza el monómero de fibrina para formar un polímero red de fibrina estabilizada. Tal red es esencial en el proceso de curación de cierre de heridas y adhesión de tejidos. La red sirve como un material de adhesión física y como un andamio para células epiteliales o células inmunológicamente activas que migran a la herida y contribuyen a la regeneración y reparación de tejidos o a la defensa contra patógenos invasores. Finalmente, la red de fibrina se disuelve gradualmente por el cuerpo (un proceso llamado fibrinólisis en ocasiones) .

Los selladores de fibrina se usan ampliamente en escenarios quirúrgicos para facilitar hemostasia y para reducir el sangrado operativo y post-operativos cuando otros métodos quirúrgicos mecánicos son inapropiados. Se usan por ejemplo durante cirugía de hígado tal como extirpación de hígado y cirugía de sustitución de rodilla y cadera. En el presente, el sellador de fibrina comercial se usa mucho en varios tipos de operaciones quirúrgicas para parar el sangrado. Además, se han presentado un gran número de técnica que emplean el uso de tal sellador de fibrina como un andamio biológico en medicina regenerativa (cell Transplantation, 7, 309-317, 1998; y Burn, 24, 621630, 1998) .

Típicamente, los selladores de fibrina consisten en dos componentes derivados de plasma humano: por ejemplo, (a) un mezcla de fibrinógeno muy concentrada compuesta principalmente por fibrinógeno junto con cantidades catalítica de Factor XIII y (b) una trombina de alta potencia. Generalmente, el coágulo (o gel de fibrina) formado después de mezclar los dos componentes se adhiere correctamente a las superficies de la herida y el tejido, lo que lleva a un efecto adhesivo y hemostático (Patente de Estados Unidos Nº 7.241.603) .

Los geles de fibrina han demostrado inducir crecimiento y diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales introducidas (CMM) , dependiendo de la concentración de FC y trombina presentes en la matriz (Catelas et al., Tissue Eng 12:2385-2396, 2006) .

Una publicación más reciente indica que las características de los hidrogeles de fibrina pueden optimizarse para mantener un tipo específico de células para la regeneración de un tejido deseado... [Seguir leyendo]

1. Un andamio con base de fibrina capaz de mantener una población de células introducidas en el andamio que comprende una concentración inicial de células de al menos 1 x 106 células/ml andamio de células madre mesenquimales (CMM) y/o células derivadas de tejido del cordón umbilical (CTU) donde el andamio se forma con un componente de fibrinógeno que comprende fibrinógeno con una concentración final superior a 17, 5 mg/ml andamio, comprendiendo el andamio CTU, CMM introducidas o una combinación de las mismas en un rango de concentración inicial de 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio, donde el andamio de fibrina está sustancialmente libre de inhibidores de proteasa añadidos, y donde el andamio que comprende CMM y/o CTU introducidas es para uso en el aumento de vascularización.

2. El andamio de acuerdo con la reivindicación 1, donde el componente de fibrinógeno se deriva de la sangre, y preferentemente el andamio está sustancialmente libre de plasmina y/o plasminógeno.

3. CTU y/o CMM para su uso en un método de aumento de vascularización en una región limitada de un sujeto que lo necesite donde el método comprende la administración de células a la región como parte de un andamio de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2.

4. Las CTU y/o CMM para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 3, donde la región es isquémica, dañada o comprende un tejido u órgano trasplantado.

5. Las CTU y/o CMM para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 3 o reivindicación 4, donde la región es un tejido muscular.

6. Las CTU y/o CMM para su uso en un método para tratar una herida donde el método comprende la administración

o formación proximal a la herida de un andamio de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 que comprende CTU y/o CMM introducidas.

7. Las CTU y/o CMM para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 6, donde el andamio es capaz de mantener las células en la herida o próximas a la herida durante un periodo de tiempo terapéuticamente efectivo, preferentemente donde el tiempo es al menos 4 día.

8. Un método para preparar un andamio para su uso en el aumento de vascularización, comprendiendo dicho métodos las etapas de: proporcionar un componente de fibrinógeno; proporcionar una componente de enzima proteolítica que es capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno; proporcionar una población de células que comprenden CMM y/o CTU; y mezclar el fibrinógeno, la enzima proteolítica y las células, donde el andamio formado comprende 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio CMM y/o CTU, donde el componente de fibrinógeno usado para formar el andamio está en una concentración final superior a 17, 5 mg/ml andamio y donde los componentes están sustancialmente libres de inhibidores de proteasa añadidos.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde el componente de fibrinógeno se deriva de la sangre y está sustancialmente libre de plasmina y/o fibrinógeno.

10. Un andamio de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 que comprende CTU y/o CMM introducidas o un andamio formado de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 para su uso en el aumento de vascularización en una región limitada en un sujeto y/o para su uso en el tratamiento de una herida.

11. Un kit para su uso en el aumento de vascularización que comprende:

(i) al menos dos recipientes separados que comprenden componentes requeridos para formar un andamio con base de fibrina, el al menos un recipiente separado comprende un componente de fibrinógeno que tiene una concentración final de fibrinógeno superior a 17, 5 mg/ml andamio formado, y el al menos segundo recipiente separado comprende un componente de enzima proteolítica que es capaz de formar fibrina cuando reacciona con fibrinógeno; y

(ii) CMM y/o CTU en una concentración de al menos 1 x 106 a 6 x 106 células/ml andamio formado, donde los componentes están sustancialmente libres de inhibidores de proteasa añadidos.

12. El kit de acuerdo con la reivindicación 11, donde las CMM y/o CTU están en un recipiente separado.

13. El kit de acuerdo con la reivindicación 11 o reivindicación 12, donde el componente de fibrinógeno se deriva de la sangre y está sustancialmente libre de plasmina y/o plasminógeno.