Xilanasa de talaromyces.

Un polipéptido de xilanasa que comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No.

2; o

(ii) una variante de al menos 90 % de identidad de la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408de SEQ ID No. 2, que es capaz de escindir el xilano; o

(iii) una variante de la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2, que tienehasta 50 sustituciones de aminoácidos y que es capaz de escindir el xilano, o

(iv) un fragmento de la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2, que escapaz de escindir el xilano.

Xilanasa de talaromyces

Campo de la Invención La presente invención se relaciona con unas xilanasas novedosas, tales como las xilanasas de Talaromyces y su uso en la degradación del xilano en la celulosa. Las xilanasas encuentran uso en el horneado, en pienso para animales (para mejorar la conversión del pienso) y en producción del papel.

Antecedentes de la invención La composición de una pared de la célula vegetal es compleja y variable y contiene varios biopolímeros de carbohidratos. Los polisacáridos principalmente se encuentran en la forma de cadenas largas de celulosa (el componente estructural principal de la pared de la célula vegetal) , hemicelulosa (que comprende varias cadenas βxilano, tales como xiloglucanos) pectina y lignina. Las hemicelulosas más abundantes son los xilanos y sus derivados tales como arabinoxilano y xiloglicano.

Las hemicelulosas vegetales incluyen xilano, arabinoxilano, glucuronoarabinoxilano y xiloglucano. El xilano (Registro CAS No. 9014-63-5) consiste de un esqueleto de unidades D-xilopiranosilo β-1, 4-ligadas, opcionalmente sustituidas con cadenas laterales tales como residuos de arabinosa y/o ácido glucurónico. La estructura es:

-4) -β-D-Xylp- (1-4) -β-D-Xylp (2<1A) - (1-4) - β-D-Xylp- (1-4) -β-D-Xylp (3<1B) - (1

(Xylp = unidad xilopiranosilo; A = unidad α- (4-O) -metil- (D-glucuronopiranosil) , en algún momento un acetil; y B = unidad α- (L-arabinofuranosil) , algunas veces un acetil) .

Los xilanos pueden representar más del 30% del peso seco de las plantas terrestres. Por lo tanto, el xilano es un componente importante de los materiales de fuentes naturales que se utilizan en los procesos industriales que van de horneado, mejora de la conversión del pienso para animal y producción del papel.

Existen diferencias básicas entre monocotiledóneas (por ejemplo cereales y pastos) y dicotiledóneas (por ejemplo trébol, colza y soja) y entre la semilla y las partes vegetativas de la planta. Las monocotiledóneas se caracterizan por la presencia de un complejo de arabinoxilano como el principal esqueleto de la hemicelulosa, y la estructura principal de las hemicelulosas en dicotiledóneas es un complejo de xiloglucano. Las concentraciones más altas de pectina se encuentran en las dicotiledóneas que en las monocotiledóneas. Las semillas por lo general son altas en sustancias pépticas pero relativamente bajas en material celulósico.

Las enzimas degradantes de la celulosa se utilizan para la elaboración de material vegetal en alimento así como aplicaciones en pienso o como un alimento o aditivo de pienso debido a su capacidad para actuar sobre los sustituyentes principales de la pared de la célula vegetal.

La mayoría de las enzimas que degradan la celulosa, disponibles para la industria parecen ser xilanasas con un peso molecular relativamente bajo y una estabilidad moderada a mayores temperaturas. Sin embargo, para ciertas aplicaciones es deseable utilizar una xilanasa con una termoestabilidad relativamente alta. Si una xilanasa es para ser utilizada como un aditivo de pienso para animal, entonces se prefiere una termoestabilidad alta debido a las condiciones de alta temperatura aplicadas durante el peletizado del pienso para animal.

Resumen de la Invención Actualmente, una xilanasa novedosa se provee, la cual es capaz de escindir el β-D-xilano tal como se presenta en el material vegetal. La xilanasa también puede ser capaz de hidrolizar el arabinoxilano (o tiene actividad de arabinoxilanasa) y una aril-β-D-xilopiranosida (o tiene actividad xilosidasa) .

En consecuencia, la presente invención provee una β-polipéptido xilanasa (aislada) que comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2; o

(ii) una variante de al menos 90 % de identidad de la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2, que es capaz de escindir el xilano; o

(iii) una variante de la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2, que tiene hasta 50 sustituciones de aminoácidos y que es capaz de escindir el xilano, o

(iv) un fragmento de la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2, que es capaz de escindir el xilano.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se provee un polinucleótido que comprende:

(a) la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID No. 1 codificante para una xilanasa o el complemento de esta o

(b) una secuencia codificante para un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente;

(c) un fragmento de al menos 100 nucleótidos de la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID No. 1 codificante para una xilanasa o el complemento de esta;

(d) una secuencia que tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia codificante de SEQ ID No. 1 codificante para una xilanasa

(e) la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID No. 1 codificante para una xilanasa o el complemento de esta o la secuencia madura de Seq ID No. 1 modificada por hasta 100 sustituciones del nucleótido;

(f) una secuencia codificante para una xilanasa que se degenera como resultado del código genético para la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID No. 1 o el complemento de esta.

(g) una secuencia que codifica para un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, que es:

(1) la secuencia codificante de los nucleótidos 69 a 1224 de SEQ ID No. 1 o

(2) una secuencia que se degenera como resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en (1) ; o

(h) una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (g) . La invención también provee:

-un vector (por ejemplo de expresión) que comprende un polinucleótido de la invención y que puede ser capaz de expresar un polipéptido de la invención;

-una línea celular que comprende un vector de la invención;

-un método para producir un polipéptido de la invención, método que comprende el mantenimiento de una línea celular de la invención, bajo condiciones apropiadas para obtener la expresión del polipéptido y, si es necesario, aislar el polipéptido;

-un método de la degradación β-D-xilano, el método que comprende poner en contacto un material que comprende β-D-xilano con un polipéptido de la invención; y

-un método para la identificación de un compuesto que modula la actividad de xilanasa, método que comprende poner en contacto un polipéptido de la invención con un compuesto de prueba en la presencia de β-D-xilano y seguimiento o detección de cualquier modulación de actividad.

Breve Descripción de las Secuencias SEQ ID No. 1, es una secuencia de ADN codificante para una la xilanasa de la invención a partir del Talaromyces emersonii;

SEQ ID No. 2, es la secuencia de aminoácidos de la xilanasa; y SEQ ID Nos. 3 y 4, son cebadores de PCR artificiales que hibridan a SEQ ID No. 1. Descripción Detallada de la Invención A. Polinucleótidos La presente invención provee un polinucleótido (por ejemplo aislado y/o purificado) codificante para un polipéptido de la invención. La presente invención provee así un polinucleótido codificante para una xilanasa cuya secuencia de aminoácidos se figura en SEQ ID No. 2 (tal como la secuencia madura de los aminoácidos 23 a 408) . La presente invención además provee un polinucleótido codificante para un polipéptido que tiene sustancial homología de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No. 2. También se incluye un polinucleótido seleccionado de:

(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, de los polinucleótidos 69 a 1224) establecida en SEQ ID No. 1, o el complemento de esta;

(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que se degenera como resultado del código genético a un polinucleótido definido en (a) , (b) o (c) .

Un polinucleótido de la invención también incluye un polinucleótido que:

(a) codifica un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, cuyo polinucleótido es:

(1) la secuencia codificante de SEQ ID No. 1 (por ejemplo, de los polinucleótidos 69 a 1224) ;

(2) una secuencia que se degenera como resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en

(1) o

(b) es una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (a) .

Las referencias a SEQ. ID. No. 1, puede ser sustituida por la secuencia codificante madura (polinucleótidos 69 a 1224) a menos que... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de xilanasa que comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2; o

(ii) una variante de al menos 90 % de identidad de la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2, que es capaz de escindir el xilano; o

(iii) una variante de la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2, que tiene hasta 50 sustituciones de aminoácidos y que es capaz de escindir el xilano, o (iv) un fragmento de la secuencia de aminoácidos a partir de los aminoácidos 23 a 408 de SEQ ID No. 2, que es capaz de escindir el xilano.

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la variante (ii) tiene al menos 95 % de identidad o el fragmento de (iv) tiene al menos 150 aminoácidos de longitud o la variante de (iii) tiene hasta 30 sustituciones de aminoácidos.

3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que escinde (1-4) enlaces o unidades de xilopiranosilo adyacentes en B-D-xilano.

4. Un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que tiene actividad de arabinoxilanasa y xilosidasa.

5. Un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que se obtiene de (a) un hongo; o (b) un organismo del género Talaromyces, opcionalmente de la especie Talaromyces emersonii.

6. Un polinucleótido que comprende:

(a) la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID No. 1 codificante para una xilanasa o el complemento de esta o

(b) una secuencia codificante para un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de acuerdo con cualquier reivindicación precedente;

(c) un fragmento de al menos 100 nucleótidos de la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID No. 1 codificante para una xilanasa o el complemento de esta;

(d) una secuencia que tiene al menos 95 % de identidad a la secuencia codificante de SEQ ID No. 1 codificante para una xilanasa

(e) la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID No. 1 codificante para una xilanasa o el complemento de esta o la secuencia madura de Seq ID No. 1 modificada por hasta 100 sustituciones de nucleótidos;

(f) una secuencia codificante para una xilanasa que se degenera como resultado del código genético para la secuencia del ácido nucleico de SEQ ID No. 1 o el complemento de esta.

(g) una secuencia que codifica para un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, que es:

(1) la secuencia codificante a partir de los nucleótidos 69 a 1224 de SEQ ID No. 1 o

(2) una secuencia que se degenera como resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en (1) ; o

(h) una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (g) .

7. Una secuencia de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el fragmento en (c) tiene al menos 200 bases de longitud o la identidad en (d) tiene al menos 98% o el número de nucleótidos modificados en (e) es hasta 50.

8. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, que es una secuencia de ADN.

9. Un vector que comprende una secuencia de polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Un vector de acuerdo con la reivindicación 9, que es un vector de expresión, tal como donde una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, se liga operativamente a una secuencia reguladora.

11. Una célula huésped, que comprende, como una secuencia heteróloga, un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

12. Una célula huésped, que expresa, como una proteína heteróloga, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

13. Una célula huésped transformada con un vector de la reivindicación 9.

14. Un proceso de producción de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el proceso que comprende el cultivo de una célula huésped, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 bajo condiciones que proveen la expresión del polipéptido.

15. Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, que además comprende un polipéptido que tiene actividad de celulasa, endo-arabinanasa, ramnogalacturonasa o poligalacturonasa.

17. Un método de tratamiento de una planta o material que contiene xilano, el método que comprende poner en contacto el material con una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el tratamiento comprende la degradación, la hidrólisis

o modificación del xilano en el material o la degradación o modificación de las paredes de las células vegetales.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, en donde el tratamiento comprende la escisión de las subunidades de xilopiranosilo o p-D-xilano y/o el material comprende una planta, pulpa vegetal, extracto de planta o un alimento comestible o ingrediente para este.

20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que reduce la viscosidad del material, degrada o hidroliza el xilano contenido en el material o mejora la claridad o capacidad de filtración del material.

21. Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16 en un método de tratamiento del material vegetal, que mejora la capacidad de filtración y/o que reduce la viscosidad de los líquidos que contienen xilano, que mejora la capacidad de filtración o que clarifica los líquidos alcohólicos como la cerveza y el vino o jugos de frutas o vegetales, la hidrólisis de residuos agrícolas, en el reciclaje de materiales como que contienen papel en la fabricación de papel para el espesamiento de productos alimenticios y/o la extracción de materiales deseables como café, aceites vegetales o almidón, procesamiento de pulpa, jugo o extractos de plantas, que mejoran el volumen del pan, la calidad del pan o que reduce la pegajosidad de la masa.

22. Un pienso, de preferencia pienso para animal, alimento o producto alimenticio que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

23. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la elaboración de la cerveza, cerveza o fabricación del vino, destilación, reciclaje, biometanación, higiene dental, tratamiento del cuero, fabricación del papel, tratamiento de extractos o jugos vegetales o frutas, tratamiento o manufactura de textiles, fabricación de pan u horneado, tratamiento de bulbos de flores, preparación de alimentos o productos alimenticios o en un pienso para animales.

24. Un alimento o producto alimenticio de acuerdo con la reivindicación 22, que es una bebida alcohólica, pan, masa

o té.

25. Un organismo de planta transgénica o parte de esta, que comprende una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.