Uso de lectinas para promover la oligomerización de glicoproteínas y de moléculas antigénicas.

Uno o más complejos no covalentes, cada complejo comprendiendo una proteína de choque térmico,

una molécula antigénica, y una lectina, en donde dicha proteína de choque térmico está glicosilada, y donde lacantidad de lectina presente en dichos complejos respecto a la cantidad de proteína de choque térmico esmayor que o igual a 50 nanogramos de lectina por microgramo de proteína de choque térmico o menor que oigual a nanogramos de lectina por microgramo de proteína de choque térmico

Uso de lectinas para promover la oligomerización de glicoproteínas y de moléculas antigénicas

1. INTRODUCCIÓN

0001 La presente invención se refiere a las áreas de terapia biológica, inmunoterapia y modulación inmune mediada por proteína de estrés. Más particularmente, la presente invención se refiere a composiciones y métodos de uso de complejos moleculares que comprenden moléculas de lectina o de tipo lectina asociadas con moléculas inmunológicamente y/o biológicamente activas para aumentar los efectos profilácticos y/o terapéuticos de las moléculas inmunológicamente y/o biológicamente activas para la prevención o tratamiento de enfermedades, en particular para la prevención o el tratamiento de cáncer o enfermedades infecciosas.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

0002 La cita o discusión de una referencia aquí no podrá ser interpretada como una admisión de que la misma es técnica anterior a la presente invención.

2.1 Respuestas Inmunes y Presentación de Antígenos 0003 El sistema inmune de un organismo reacciona con dos tipos de respuestas a los agentes patógenos u otros agentes dañinos: la respuesta humoral y la respuesta mediada por células (véase Alberts, B. et al., 1994, Biología Molecular de la Célula, 1195-96) . Cuando las células B en reposo son activadas por antígeno para proliferar y madurar en células secretoras de anticuerpos, producen y secretan anticuerpos con un único sitio de unión al antígeno. Esta reacción secretora de anticuerpos se conoce como la respuesta humoral. Por otro lado, las diversas respuestas de células T se denominan colectivamente reacciones inmunes mediadas por células. Hay dos clases principales de células T, células T citotóxicas y células T coadyuvantes. Las células T citotóxicas directamente matan células que están infectadas con un virus o algún otro microorganismo intracelular. Las células T coadyuvantes, por el contrario, ayudan a estimular las respuestas de otras células: ayudan a activar macrófagos, células dendríticas y células B, por ejemplo (ver Alberts, B. et al., supra, en 1228) . Tanto las células T citotóxicas como las células T coadyuvantes reconocen el antígeno en la forma de fragmentos de péptidos que son generados por la degradación de los antígenos proteicos extraños en el interior de la célula diana, y ambos, por lo tanto, dependen de moléculas de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) , que se unen a estos fragmentos de péptidos, los llevan a la superficie celular, y los presentan a las células T. Las moléculas MHC normalmente se encuentran en abundancia en las células presentadoras de antígeno (APCs) .

0004 Las células presentadoras de antígeno (APCs) , como los macrófagos y células dendríticas, son componentes clave de la respuesta inmune innata y adaptativa. Los antígenos son generalmente 'presentados' a las células T o células B en la superficie de otras células, las APCs. Las APCs pueden atrapar antígenos de transmisión linfática y sanguínea y, después de internalización y degradación, presentan fragmentos de péptidos antigénicos, unidos a moléculas de la superficie celular del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) , a las células T. Las APCs puede entonces activar células T (respuesta mediada por células) para expansión clonal, y estas células hijas pueden desarrollarse tanto en las células T citotóxicas o células T coadyuvantes, que a su vez activan células B (respuesta humoral) con el mismo antígeno unido a MHC para expansión clonal y producción del anticuerpo específico (ver Alberts, B. et al., supra, en 1238-45) .

0005 Dos tipos de mecanismos de procesamiento de antígeno han sido reconocidos. El primer tipo implica absorción de proteínas mediante endocitosis por APCs, fragmentación de antígeno dentro de vesículas, asociación con las moléculas MHC de clase II y expresión en la superficie celular. Este complejo es reconocido por células T coadyuvantes que expresan CD4. El otro se emplea para proteínas, tales como antígenos víricos, que se sintetizan dentro de la célula y parece implicar fragmentación de proteínas en el citoplasma. Los péptidos producidos de esta manera quedan asociados con moléculas MHC de clase I y son reconocidos por células T citotóxicas que expresan CD8 (ver Alberts, B. et al., supra. at 1233-34) .

0006 La estimulación de células T implica una serie de moléculas accesorias expresadas tanto por las células T como por las APCs. Las moléculas co-estimuladoras son aquellas moléculas accesorias que promueven el crecimiento y la activación de la célula T. Tras la estimulación, las moléculas co-estimuladoras inducen la liberación de citoquinas, tales como interleucina 1 (IL-1) o interleucina 2 (IL-2) , el interferón, etc., que promueven el crecimiento de células T y la expresión de receptores de la superficie (ver Paul, 1989 , Fundamental Immunology, 109-10) .

0007 Normalmente, las APCs están en reposo y requieren la activación de su función. La identidad de las señales que activan las APCs es una cuestión crucial y sin resolver (ver Banchereau, et al., 1998, Nature, 392:245-252; Medzhitov, et al., 1998, Curr Opin Immunol., 10:12-15) .

2.2 Proteínas de Choque Térmico 0008 Las proteínas de choque térmico (HSPs) , también conocidas como proteínas de estrés, se identificaron por primera vez como proteínas sintetizadas por las células en respuesta al choque térmico. Aproximadamente diez familias de HSPs son conocidas, y cada familia consta de uno a cinco proteínas homólogas estrechamente relacionadas. Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425. Se encontró posteriormente que muchos miembros de estas familias son inducidos en respuesta a otros estímulos estresantes, incluyendo privación de nutrientes, alteración metabólica, radicales de oxígeno, e infección con patógenos intracelulares (ver Welch, Mayo 1993, Scientific American, 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol., 8:401-420; Craig, 1993, Science, 260:1902-1903; Gething et al., 1992, Nature, 355: 33-45; and Lindquist et al., 1988, Annu. Rev. Genetics, 22:631-677) .

0009 Las proteínas de choque térmico se expresan en todas las células en todas las formas de vida y en una variedad de localizaciones intracelulares, es decir, se expresan en el citosol de los procariotas y en el citosol, núcleos, retículo endoplásmico (RE) , mitocondrias, y cloroplastos de las eucariotas. Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425. Las HSPs también constituyen el grupo simple más abundante de proteínas dentro de las células. Se expresan en grandes cantidades bajo condiciones normales de choque no térmico, y su expresión puede ser fuertemente inducida a niveles mucho más altos como resultado de un choque térmico u otras formas de estrés.

0010 Proteínas de choque térmico están entre las proteínas más altamente conservadas en existencia. Por ejemplo, DnaK, la Hsp70 de E. coli tiene aproximadamente 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con proteínas Hsp70 de excoriados (Bardwell et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:848-852) . Las familias Hsp60 y Hsp90 también muestran niveles similares de conservación intrafamiliar (Hickey et al., 1989, Mol. Cell. Biol., 9:2615-2626; Jindal, 1989, Mol. Cell. Biol., 9:2279-2283) . Además, se ha descubierto que las familias Hsp60, Hsp70 y Hsp90 están compuestas de proteínas que están relacionadas con las proteínas de estrés en secuencia, por ejemplo, con identidad de aminoácidos mayor que 35%, pero cuyos niveles de expresión no son alterados por el estrés.

0011 Estudios sobre respuesta celular al choque térmico y otros estreses fisiológicos revelaron que las HSPs poseen funciones como despliegue y repliegue de proteínas, degradación de proteínas, conjunto de complejos de múltiples subunidades, termotolerancia, tamponamiento de expresión de mutaciones, entre otros. Srivastava, 2002, Annu. Rev. Immunol. 20:395-425. Las HSPs cumplen diferentes tipos de funciones chaperonas. Por ejemplo, miembros de la familia Hsp70, situados en el citoplasma de la célula, el núcleo, las mitocondrias, o retículo endoplásmico (Lindquist et al., 1988, Ann. Rev. Genetics, 22:631-677) , están implicados en la presentación de antígenos a las células del sistema inmune, y también están implicados en la transferencia, plegado y ensamblaje de proteínas en la células normales. Las HSPs son capaces de unir proteínas o péptidos, y de liberar las proteínas o péptidos ligados en la presencia de trifosfato de adenosina (ATP) o pH bajo.

2.3 Inmunogenicidad de Complejos HSP-Péptido 0012 Srivastava et al. Demostraron la respuesta inmune a sarcomas inducidos por metilcolantreno de ratones consanguíneos (1988, Immunol. Today, 9:78-83) . En estos... [Seguir leyendo]

1. Uno o más complejos no covalentes, cada complejo comprendiendo una proteína de choque térmico, una molécula antigénica, y una lectina, en donde dicha proteína de choque térmico está glicosilada, y donde la cantidad de lectina presente en dichos complejos respecto a la cantidad de proteína de choque térmico es mayor que o igual a 50 nanogramos de lectina por microgramo de proteína de choque térmico o menor que o igual a 5 nanogramos de lectina por microgramo de proteína de choque térmico.

2. Los complejos de la reivindicación 1, en donde la lectina presente en dichos complejos en relación a la cantidad de proteína de choque térmico o glicoproteína es de 50 a 1000 nanogramos de lectina por microgramo de proteína de choque térmico o glicoproteína.

3. Los complejos de la reivindicación 1, en donde la lectina presente en dichos complejos en relación a la cantidad de proteína de choque térmico es de 100 a 500 nanogramos de lectina por microgramo de proteína de choque térmico.

4. Los complejos de la reivindicación 1, en donde la lectina presente en dichos complejos en relación a la cantidad de proteína de choque térmico o glicoproteína es de 0.1 a 1 nanogramo de lectina por microgramo de proteína de choque térmico o glicoproteína.

5. Los complejos de la reivindicación 1, en donde la lectina presente en dichos complejos en relación a la cantidad de proteína de choque térmico es de 0.5 a 1 nanogramo de lectina por microgramo de proteína de choque térmico.

6. Los complejos de la reivindicación 1, en donde la relación molar entre la proteína de choque térmico y la lectina es 3:1, 2:1, o 1:1.

7. Los complejos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha lectina está en forma de un dímero o un oligómero.

8. Los complejos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha lectina es una lectina de unión a manosa.

9. Los complejos de la reivindicación 8, en donde dicha lectina de unión a manosa es Concanavalina A (Con A) .

10. Los complejos de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha proteína de choque térmico se selecciona del grupo que consiste de gp96, Calreticulin, y GRP170.

11. Los complejos de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha proteína de choque térmico es gp96.

12. Los complejos de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dichos complejos son purificados.

13. Los complejos de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dicha molécula antigénica es una molécula antigénica que muestra uno o más determinantes antigénicos contra los que se desea una respuesta inmune en un sujeto.

14. Los complejos de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde un complejo de dicha proteína de choque térmico y dicha molécula antigénica es aislado del tejido canceroso.

15. Los complejos de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dicha molécula antigénica es un antígeno específico de tumor o un antígeno asociado a tumor.

16. Los complejos de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dicha molécula antigénica muestra la antigenicidad de un antígeno de un agente infeccioso.

17. Un método de preparación de la población de uno o más complejos no covalentes según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, dicho método comprendiendo las etapas de:

a) ligar dicha lectina a dicha proteína de choque térmico, y

b) complejar dicha proteína de choque térmico a dicha molécula antigénica.

18. Un método de preparación de la población de uno o más complejos no covalentes según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, dicho método comprendiendo ligar una lectina a uno o más complejos, cada complejo comprendiendo una proteína de choque térmico glicosilada y una molécula antigénica, en donde dicha lectina no está ligada a una fase sólida.

19. El método de la reivindicación 18, que comprende además aislar dichos complejos de proteína de choque térmico y molécula antigénica por cromatografía de afinidad basada en lectina antes de ligar dichos complejos a lectinas.

20. El método de la reivindicación 18, que comprende además aislar dichos complejos de proteína de choque térmico y molécula antigénica por cromatografía no basada en lectina antes de ligar dichos complejos a dicha lectina.

21. El método de la reivindicación 20, en donde dicha cromatografía no basada en lectina es cromatografía de afinidad basada en anticuerpos.

22. El método de la reivindicación 18, en el que la lectina se añade durante el proceso de purificar el uno o más complejos no covalentes.

23. El método de la reivindicación 19, en el que la lectina se añade durante el proceso de purificar el uno o más complejos no covalentes utilizando una columna de scFv gp96-específica, en el que la proteína de choque térmico en el uno o más complejos no covalentes es gp96.

24. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable, y uno o más complejos no covalentes según cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

25. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, para su uso en un método para el tratamiento o prevención de un cáncer o una enfermedad infecciosa en un sujeto.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 24, para su uso como un medicamento.

27. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, en la que un complejo de dicha proteína de choque térmico y dicha molécula antigénica es aislado de tejido canceroso.

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, en donde dicha molécula antigénica es un antígeno específico de tumor o un antígeno asociado a tumor.

29. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, en donde dicha molécula antigénica muestra la antigenicidad de un antígeno de un agente infeccioso.

30. La composición farmacéutica de la reivindicación 27 o 28, para uso en un método para el tratamiento de un cáncer en un sujeto que tiene cáncer.

31. La composición farmacéutica de la reivindicación 29, para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que tiene una enfermedad infecciosa.

32. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 25, 30, o 31, en donde el sujeto es un mamífero.

33. La composición farmacéutica de la reivindicación 32, en donde el mamífero es un humano.

34. El uso de uno o más complejos de la reivindicación 14 o 15, para la elaboración de un medicamento para uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto que tiene cáncer.

35. El uso de uno o más complejos de la reivindicación 16, para la elaboración de un medicamento para uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que tiene una enfermedad infecciosa.

36. Una composición que comprende una población de complejos no covalentes, en la que dichos complejos no covalentes son de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

37. La composición de la reivindicación 36 para uso como un medicamento.

38. La composición de la reivindicación 37, en la que un complejo de dicha proteína de choque térmico y dicha molécula antigénica es aislado de tejido canceroso.

39. La composición de la reivindicación 37, en donde dicha molécula antigénica es un antígeno específico de tumor o un antígeno asociado a tumor.

40. La composición farmacéutica de la reivindicación 37, en donde dicha molécula antigénica muestra la antigenicidad de un antígeno de un agente infeccioso.

41. La composición de la reivindicación 38 o 39, para su uso en un método para el tratamiento de un tipo de cáncer en un sujeto que tiene cáncer.

42. La composición de la reivindicación 40, para uso en un método para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que tiene una enfermedad infecciosa.

43. La composición de la reivindicación 36, para su uso en un método para el tratamiento o la prevención de cáncer o una enfermedad infecciosa.

44. Uso de la composición de la reivindicación 38 o 39, para la elaboración de un medicamento para uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto que tiene cáncer.

45. Uso de la composición de la reivindicación 40 para la elaboración de un medicamento para uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto que tiene una enfermedad infecciosa.

46. Uso de la composición de la reivindicación 36 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de cáncer o una enfermedad infecciosa.

47. Un kit que comprende:

a) un primer recipiente que contiene una composición que comprende una población de complejos no covalentes según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, b) un segundo recipiente que contiene una lectina purificada.

48. El kit de la reivindicación 47, en el que la molécula antigénica muestra la antigenicidad de un antígeno de un cáncer o de un antígeno de un agente de una enfermedad infecciosa.

49. El kit de la reivindicación 47, en el que la lectina es una lectina de unión a manosa.

50. El kit de la reivindicación 47, en el que la lectina de unión a manosa es Concanavalina A (Con A) .

51. El kit de cualquiera de las reivindicacione.

4. 50, en el que la proteína de choque térmico se selecciona del grupo que consta de gp96, Calreticulin, y GRP170.

52. El kit de cualquiera de las reivindicacione.

4. 50, en el que la proteína de choque térmico es gp96.