Uso de ácidos nucleicos de PITX2 para mejorar el tratamiento de trastornos proliferativos de células mamarias.

Uso de

i) una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia de al menos 18 bases delongitud de una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEC ID Nº411,

412, 515, 516, 685, 686, 789 y 790, y secuencias complementarias de las mismas,

ii) un oligonucleótido o PNA-oligómero que consiste en al menos una secuencia de bases quetiene una longitud de al menos nucleótidos que es complementaria o idéntica a una de lassecuencias de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID Nº 515, 686 y 789,

iii) un conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con ii), o

iv) un kit que comprende un reactivo bisulfito(≥ bisulfito, hdrógeno sulfito) así comooligonucleótidos y/o PNA-oligómeros de acuerdo con ii) o iii)

para el análisis del patrón de mutilación de PITX2 para predecir la respuesta de los pacientes contrastornos proliferativos de células mamarias a una terapia complementaria, que comprende uno o másfármacos dirigidos a la vía del receptor de estrógenos o están implicados en el metabolismo,producción o secreción de estrógenos, en el que dicho uno o más fármacos se seleccionan detamoxifeno, inhibidores de la aromatasa, moduladores selectivos de los receptores de estrógenos yanálogos de LH-RH y en el que dichos fármacos bloquean los efectos de los estrógenos sobre lascéulas cancerosas o reducen los niveles de estrógenos en suero.

Uso de ácidos nucleicos de PITX2 para mejorar el tratamiento de trastornos proliferativos de células mamarias Campo de la invención Los niveles de observación que se han estudiado mediante los desarrollos metodológicos de los últimos años en biología molecular son los propios genes, la traducción de estos genes en ARN y las proteínas resultantes. La cuestión de qué gen está activado en qué punto en el transcurso del desarrollo de un individuo y cómo se controlan la activación e inhibición de genes específicos en células y tejidos específicos se correlaciona con el grado y el carácter de la metilación de los genes o del genoma. A este respecto, los propios estados patogénicos pueden manifestarse en un patrón de metilación modificado de genes individuales o del genoma.

La metilación del ADN desempeña un papel, por ejemplo, en la regulación de la transcripción, en la huella genética y en la tumorigénesis. Por tanto, la identificación de 5-metilcitosina como componente de la información genética es de considerable interés. Sin embargo, las posiciones de 5-metilcitosina no pueden identificarse mediante secuenciación puesto que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Además, la información epigenética portada por la 5-metilcitosina se pierde completamente durante la amplificación por PCR.

Un procedimiento relativamente nuevo y actualmente el más frecuentemente usado para analizar el ADN para determinar la 5-metilcitosina se basa en la reacción específica de bisulfito con citosina que, tras hidrólisis alcalina posterior, se convierte en uracilo que se corresponde con timidina en su comportamiento de apareamiento de bases. Sin embargo, la 5-metilcitosina permanece sin modificar en estas condiciones. Por consiguiente, el ADN original se convierte de una manera tal que la metilcitosina, que originalmente no podía distinguirse de la citosina por su comportamiento de hibridación, puede detectarse ahora como la única citosina restante usando técnicas de biología molecular “normales”, por ejemplo, mediante amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas se basan en el apareamiento de bases que puede ahora explotarse totalmente. En cuanto a la sensibilidad, la técnica anterior se define mediante un procedimiento que encierra el ADN que va a analizarse en una matriz de agarosa, evitando así la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito sólo reacciona con ADN monocatenario) , y que sustituye todas las etapas de precipitación y purificación por diálisis rápida (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 15 de diciembre de 1996; 24 (24) :5064-6) . Usando este procedimiento, es posible analizar células individuales, lo que ilustra el potencial del procedimiento. Sin embargo, actualmente sólo se analizan regiones individuales de una longitud de hasta aproximadamente 3000 pares de bases, no es posible un análisis global de células para miles de posibles acontecimientos de metilación. Sin embargo, este procedimiento tampoco puede analizar de manera fiable fragmentos muy pequeños de cantidades de muestra pequeñas. Estas se pierden por la matriz a pesar de la protección de la difusión.

Una visión general de los procedimientos conocidos adicionales de detección de 5-metilcitosina puede recogerse del siguiente artículo de revisión: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Hasta la fecha, excluyendo pocas excepciones (por ejemplo, Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. marzo – abril de 1997; 5 (2) :94-8) , la técnica de bisulfito se usa sólo en investigación. Siempre, sin embargo, se amplifican fragmentos cortos específicos de un gen conocido después de un tratamiento con bisulfito y o bien se secuencian completamente (Olek A, Walter J. The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. Noviembre de 1997; 17 (3) :275-6) o bien se detectan las posiciones de citosina individuales mediante una reacción de extensión de cebador (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) . Nucleic Acids Res. 15 de junio de 1997; 25 (12) :2529-31, documento WO 95/00669) o mediante digestión enzimática (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 15 de junio de 1997; 25 (12) :2532-4) . Además, también se ha descrito la detección mediante hibridación (Olek et al., documento WO 99/28498) .

Otras publicaciones que tratan el uso de la técnica de bisulfito para la detección de la metilación en genes individuales son: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. Junio de 1994; 16 (6) :431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. Marzo de 1997; 6 (3) :387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 25 de febrero de 1994; 22 (4) :695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5’ region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 19 de mayo de 1995; 157 (1-2) :261-4; documentos WO 97/46705, WO 95/15373 y WO 97/45560.

Una visión general de la técnica anterior en la fabricación de series de oligómeros puede recogerse de una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, volumen 21, enero de 1999) , publicado en enero de

1999, y de la bibliografía citada en ese documento.

Con frecuencia se usan sondas marcadas con fluorescencia para la exploración de series de ADN inmovilizado. La simple unión de colorantes Cy3 y Cy5 al OH en 5’ de la sonda específica es particularmente adecuada para marcadores de fluorescencia. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas puede llevarse a cabo, por ejemplo, por medio de un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, están comercialmente disponibles.

La espectrometría de masas de desorción – ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficaz para el análisis de biomoléculas (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionisation of proteins with molecular masses exceeding 10, 000 daltons. Anal Chem. 15 de octubre de 1988; 60 (20) :2299-301) . Se incrusta un analito en una matriz de absorción de luz. La matriz se evapora mediante un pulso de láser corto transportando así la molécula de analito hacia la fase de vapor de una manera sin fragmentar. Se ioniza el analito mediante colisiones con moléculas de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones en un tubo de vuelo sin campo. Debido a sus diferentes masas, los iones se aceleran a diferentes velocidades. Iones más pequeños alcanzan el detector antes que iones más grandes.

La espectrometría de MALDI-TOF se adecua excelentemente al análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es un tanto más difícil (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometr y . Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57) . La sensibilidad a ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces peor que a péptidos y disminuye de manera no proporcional con el aumento del tamaño de los fragmentos. Para ácidos nucleicos que tienen una estructura principal con múltiples cargas negativas, el proceso de ionización por medio de la matriz es considerablemente menos eficaz. En espectrometría de MALDI-TOF, la selección de la matriz desempeña un papel sumamente importante. Para la desorción de péptidos, se han encontrados varias matrices muy eficaces que producen una cristalización muy fina. Ahora hay varias matrices sensibles para ADN, sin embargo, no se ha reducido la diferencia en sensibilidad. La diferencia en sensibilidad puede reducirse modificando químicamente el ADN de tal manera que se vuelva más similar a un péptido. Los ácidos nucleicos de fosforotioato, en los que los fosfatos habituales de la estructura principal se sustituyen por tiofosfatos, pueden convertirse en un ADN de carga neutra usando química de alquilación simple (Gut IG, Beck S. A procedure for selective... [Seguir leyendo]

1. Uso de i) una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia de al menos 18 bases de longitud de una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEC ID Nº 5 411, 412, 515, 516, 685, 686, 789 y 790, y secuencias complementarias de las mismas,

ii) un oligonucleótido o PNA-oligómero que consiste en al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 10 nucleótidos que es complementaria o idéntica a una de las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID Nº 515, 686 y 789,

iii) un conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con ii) , o iv) un kit que comprende un reactivo bisulfito (= bisulfito, hdrógeno sulfito) así como oligonucleótidos y/o PNA-oligómeros de acuerdo con ii) o iii)

para el análisis del patrón de mutilación de PITX2 para predecir la respuesta de los pacientes con trastornos proliferativos de células mamarias a una terapia complementaria, que comprende uno o más fármacos dirigidos a la vía del receptor de estrógenos o están implicados en el metabolismo,

producción o secreción de estrógenos, en el que dicho uno o más fármacos se seleccionan de tamoxifeno, inhibidores de la aromatasa, moduladores selectivos de los receptores de estrógenos y análogos de LH-RH y en el que dichos fármacos bloquean los efectos de los estrógenos sobre las céulas cancerosas o reducen los niveles de estrógenos en suero.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque al menos un oligonucleótido 20 está unido a una fase sólida.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho al menos un oligonucleótido se usa para la amplificación de secuencias de ácido nucleico que comprenden una de SEC ID Nº 515, 686, 789 y secuencias complementarias de las mismas.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho kit comprende reactivos estándar para

realizar un ensayo de mutilación del grupo que consiste en MS-SNuPE, MSP, metilo ligero, metilo pesado, secuenciación de ácidos nucleicos y combinaciones de los mismos.