Un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tiene actividad insulinotrópica.

Un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tenga un sitio de reconocimiento N-terminalHis-Gly con actividad insulinotrópica,

comprendiendo el método las etapas de:

a) transformar una célula hospedadora modificada genéticamente que tiene supresión del gen de proteasaSTE13, con un vector polinucleotídico que codifica el polipéptido;

b) cultivar la célula hospedadora transformada para producir el polipéptido; y

c) alfa-amidar el polipéptido para producir polipéptido biológicamente activo.

Un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tiene actividad insulinotrópica

Campo de la invención La presente invención proporciona un sistema para producir un péptido insulinotrópico (por ejemplo, Exendina-4) clonando y expresando el péptido nativo o una forma modificada por ingeniería genética del péptido en un microorganismo o microorganismos modificados genéticamente tales como levadura en los que el gen de aminopeptidasa se altera, para permitir una expresión eficaz de la proteína o el polipéptido de longitud completa.

Antecedentes y técnica anterior de la invención Las exendinas son una familia de péptidos que reducen los niveles de glucosa en sangre y tienen alguna similitud de secuencia (53%) con GLP-1 (Goke et al., 1993 J. Biol. Chem. 268; 19650-19655) . Las exendinas se encuentran en el veneno del Monstruo de Gila (Heloderma suspectum; Raufman 1996 Reg. Peptides, 61; 1-18) y el lagarto moteado mejicano. La Exendina-4 hallada en el veneno del Monstruo de Gila es de interés particular. El precursor de Exendina-4 es un polipéptido de 87 aminoácidos que incluye señal y prosecuencias (Secuencia ID Nº: 1) . Se procesa para proporcionar la Exendina-4 de 39 aminoácidos amidada (Secuencia ID Nº: 2) . La solicitud de patente internacional PCT publicada WO 98/35033, describe el ADNc que codifica el péptido proexendina, incluyendo exendina y otros péptidos nuevos, su aislamiento y anticuerpos que reconocen específicamente tales péptidos (Pohl et al. 1998, J. Biol. Chem. 273; 9778-9784) . Se ha mostrado que la Exendina-4 es un fuerte agonista del receptor de GLP-1 en células de insulinoma de rata aisladas. También tiene una semivida biológica mayor en comparación con GLP-1 (Young et al. 1999 Diabetes 48; 1026-1034) . Esto puede ser esperado porque el dominio His-Ala de GLP-1

activo (Secuencia ID Nº: 3) reconocido por DPP-IV no está presente en Exendina-4, que tiene la secuencia His-Gly en su lugar.

La Exendina-4 proporcionada reduce sistémicamente los niveles de glucosa en sangre en 40% en ratones db/db diabéticos (documento WO 99/07404) . La Patente de Estados Unidos 5.424.286 de Eng, describe que una parte considerable de la secuencia N-terminal es esencial para conservar la actividad insulinotrópica.

El número de restos de aminoácidos en una secuencia peptídica tiene una influencia drástica en los costes de producción de péptidos compuestos por química sintética de fase sólida. El coste de fabricar un péptido de 50 unidades es al menos 5 veces mayor que el coste de un péptido de 10 unidades. La síntesis peptídica de fase sólida también requiere el uso de disolventes corrosivos tales como TFS y ácidos fluorhídricos, se requieren varias etapas sintéticas para producir el péptido y purificación posterior del péptido. Por lo tanto, existe la necesidad de un método eficaz y rentable para producir grandes cantidades de Exendina-4 biológicamente activa y otros péptidos insulinotrópicos.

La expresión de una proteína o un polipéptido recombinante en Pichia u otros microorganismos no siempre da como resultado la producción exitosa de polipéptido de longitud completa. Con frecuencia, el polipéptido/proteína recombinante heterólogo se somete a escisión/degradación por proteasas de forma intracelular. Dada la estructura de una proteína y la multiplicidad de proteasas presentes en la célula, la especificidad de la secuencia de aminoácidos reconocida por o marcada como objetivo por la proteasa es en muchos casos indeterminada y no está

publicada. Por lo tanto, no es posible que un experto en la materia averigüe qué proteasa sería responsable de la escisión/degradación de un polipéptido/proteína recombinante específico. Por ejemplo, se ha indicado que la expresión de endostatina murina o humana en Pichia condujo a un producto que carecía de lisina C-terminal (Folkman et al, mayo 1999; 15 (7) : 563-72) . Cuando se alteró el homólogo de Pichia del gen KEX-1 de Saccharomyces cerevisiae, el hospedador de Pichia secretó endostatina de longitud completa al medio. En otro 50 estudio se indicó que la alteración de KEX-2, pero no el gen YPS-1, en Pichia permitió la producción de gelatina de mamífero, que se escindía en sitios monoargilínicos de la proteína (Werten y de Wolf, Applied and Environmental Microbiology, mayo de 2005; 71 (5) : 231 0-7) .

La presente invención demuestra la prevención de la escisión proteolítica in vivo de proteínas/polipéptidos que 55 tengan los aminoácidos HG (His-Gly) en el extremo N-terminal con la alteración del homólogo del gen STE 13 de Saccharomyces cerevisiae en Pichia. Muy específicamente se ha mostrado que el problema asociado con la escisión proteolítica de Exendina-4 extendida con Glicina (GlyExendina-4, precursor de Exendina-4 con glicina Cterminal) se resuelve por alteración del homólogo del gen STE 13 de Saccharomyces cerevisiae en Pichia.

El documento WO 1998/01535 describe la producción de un polipéptido con actividad insulinotrópica en levadura que tiene actividad proteasa reducida, no siendo esa proteasa STE13.

El documento WO 2005/100388 describe la producción de un polipéptido con actividad insulinotrópica por amidación alfa del polipéptido después de la expresión.

El documento WO 2004/078777 describe la preparación de polipéptidos protegidos por proteasa por modificación Nterminal, en la que dicha modificación N-terminal es adición de aminoácidos después de la expresión.

Objetos de la invención El principal objeto de la presente invención es producir un polipéptido biológicamente activo. Otro objeto principal de la presente invención es producir un péptido insulinotrópico, Exendina-4.

Otro objeto más de la presente invención es desarrollar un método para producir el péptido insulinotrópico. Otro objeto más de la presente invención es desarrollar un método para expresar un polipéptido de longitud completa a partir de la célula hospedadora de Pichia.

Otro objeto más de la presente invención es desarrollar un método para amidar el péptido insulinotrópico.

Declaración de la invención La presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tenga un sitio de reconocimiento N-terminal His-Gly con actividad insulinotrópica, comprendiendo el método las etapas de: (a) transformar una célula hospedadora modificada genéticamente que tiene supresión del gen de proteasa STE13, con un vector polinucleotídico que codifica el polipéptido; y (b) cultivar la célula hospedadora transformada para producir el polipéptido y (c) alfa-amidar el polipéptido para producir un polipéptido biológicamente activo; y un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tenga un sitio de reconocimiento N-terminal His-Gly con actividad

insulinotrópica, comprendiendo el método las etapas de: (a) transformar una Pichia pastoris modificada genéticamente que tiene supresión del gen de proteasa STE13, con un vector polinucleotídico que codifica el polipéptido; y (b) cultivar la Pichia pastoris transformada para producir el polipéptido biológicamente activo.

Descripción detallada de la invención La presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tenga actividad insulinotrópica, comprendiendo el método las etapas de:

a. transformar una célula hospedadora modificada genéticamente que tiene supresión del gen de proteasa 35 STE13, con un vector polinucleotídico que codifica el polipéptido; y

b. cultivar la célula hospedadora transformada para producir el polipéptido; y

c. alfa amidar el polipéptido para producir un polipéptido biológicamente activo. En otra realización más de la presente invención, la célula hospedadora es célula de levadura. En otra realización más de la presente invención, la célula de levadura es Pichia pastoris. En otra realización más de la presente invención, el gen de proteasa es el gen STE13.

En otra realización más de la presente invención, el gen de proteasa es dipeptidil peptidasa N-terminal.

En otra realización más de la presente invención, el método implica cultivar las células transformadas en condiciones que induzcan la expresión del polipéptido. La presente invención también se refiere a un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tenga un sitio de reconocimiento N-terminal His-Gly con actividad insulinotrópica, comprendiendo el método las etapas de:

a. transformar una Pichia pastoris modificada genéticamente que tenga supresión del gen de proteasa STE13,

con un vector polinucleotídico que codifica el polipéptido;... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tenga un sitio de reconocimiento N-terminal His-Gly con actividad insulinotrópica, comprendiendo el método las etapas de:

a) transformar una célula hospedadora modificada genéticamente que tiene supresión del gen de proteasa STE13, con un vector polinucleotídico que codifica el polipéptido; b) cultivar la célula hospedadora transformada para producir el polipéptido; y c) alfa-amidar el polipéptido para producir polipéptido biológicamente activo.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la célula hospedadora es célula de levadura.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la célula de levadura es Pichia pastoris.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el gen de proteasa es un gen de dipeptidil peptidasa Nterminal.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células transformadas se cultivan en condiciones que inducen la expresión del polipéptido. 20

6. Un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tenga un sitio de reconocimiento N-terminal His-Gly con actividad insulinotrópica, comprendiendo el método las etapas de:

a) transformar una Pichia pastoris modificada genéticamente que tiene supresión del gen de proteasa STE13, 25 con un vector polinucleotídico que codifica el polipéptido; y b) cultivar la Pichia pastoris transformada para producir el polipéptido biológicamente activo.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el polipéptido es GlyExendina-4 de SEC ID Nº: 4.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la GlyExendina-4 tiene la secuencia polinucleotídica correspondiente de SEC ID Nº 5.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el polipéptido de GlyExendina-4 se pone en contacto con una enzima alfa-amidante C-terminal para producir un polipéptido de exendina-4 alfa-amidado. 35

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el polipéptido de exendina-4 alfa-amidado es HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2.

Figura 1