Purificación de un fibrinógeno.

Procedimiento para la purificación de unas soluciones que contienen fibrinógeno,

caracterizado por que contieneuna o varias etapas de procedimiento, en la(s) que se empobrece(n) una o varias proteínas contaminantes medianteuna o varias cromatografías negativas y/o una o varias adsorciones negativas, en cada caso mediando utilización deun gel de un colorante, llevándose a cabo la cromatografía negativa y/o la adsorción negativa a un valor del pHcomprendido entre 5,5 y 9.

Purificación de un fibrinógeno El presente invento se refiere a un procedimiento para la purificación de un fibrinógeno, que está caracterizado porque contiene una o varias etapas de procedimiento, en las que una o varias proteínas contaminantes se empobrecen mediante una cromatografía negativa y/o una adsorción negativa, en cada caso mediando utilización de un gel de un colorante.

Un fibrinógeno desempeña un cometido clave en el caso de la coagulación de la sangre. En el caso de traumatismos o de operaciones quirúrgicas, casi siempre son dañados algunos vasos sanguíneos, y resultan hemorragias. Mediante la coagulación de la sangre, esta sangre se solidifica en la zona de heridas más pequeñas, y la hemorragia pasa a detenerse. El sistema de coagulación protege al cuerpo de este modo frente a altas pérdidas de sangre. En el caso de la coagulación de la sangre, el fibrinógeno soluble que está contenido en el plasma sanguíneo, es transformado en presencia de trombina en la fibrina insoluble, de tipo fibroso. Si falta fibrinógeno, entonces la coagulación de la sangre no funciona correctamente. Se puede compensar este defecto administrando un fibrinógeno, que ha sido aislado p.ej. a partir de un plasma sanguíneo humano. A causa de su importancia para la hemóstasis y la cicatrización de las heridas, un fibrinógeno tiene una alta importancia en el uso clínico.

Debido a esta alta importancia clínica de un fibrinógeno, en la bibliografía hay numerosas referencias, que se ocupan de diferentes métodos para la purificación de esta importante proteína. La purificación de un fibrinógeno se efectúa predominantemente a partir de un plasma humano, más raramente también a partir de un plasma animal. Asimismo, es posible realizar una purificación de un fibrinógeno producido por vía recombinante, p.ej. a partir del cultivo de células después de una expresión recombinante, o también a partir de la leche de animales transgénicos.

El plasma humano contiene una compleja mezcla de más que 100 proteínas, constituyendo un fibrinógeno aproximadamente un 2 % de la cantidad total de proteínas. La purificación y el aislamiento de un fibrinógeno requieren, por lo tanto, por regla general, varias etapas, y las posibilidades de combinación de estas etapas individuales del procedimiento son muy numerosas y variadas.

Una parte componente importante de la purificación de un fibrinógeno procedente de un plasma humano es tradicionalmente la precipitación. Los métodos conocidos de precipitación utilizan unos aminoácidos tales como glicina o alanina, véanse, por ejemplo, el documento de patente europea EP 0 383 234, el documento de solicitud de patente internacional WO 01/48016 o la cita bibliográfica de Jakobsen & Kierulf (Thrombosis Research 3 (1973) 145159) , sulfato de amonio, véanse por ejemplo los documentos de patentes de los EE.UU. US 5.773.033, US

6.037.457 o la cita bibliográfica de Takeda (Journal of Clinical Investigation 45 (1966) 103-111) , unos polímeros tales como, por ejemplo, un poli (etilenglicol) (PEG) , véase, por ejemplo, el documento WO 95/25748 o la cita bibliográfica de Vila y colaboradores (Thrombosis Research 39 (1985) 651-656) , etanol, véase, por ejemplo, el documento EP 0 408 029, en donde un fibrinógeno es precipitado con 5-10 % de etanol, y separado de otras proteínas plasmáticas,

o el documento US 5.099.003, o la cita bibliográfica de Blombäck & Blombäck (Arkiv För Kemi 10 (1956) 415-443) , unos polisacáridos sulfatados (SPS, p.ej. heparina) , véanse por ejemplo los documentos WO 99/37680 y US 4.210.580, y unas soluciones con una pequeña fuerza iónica, véanse por ejemplo el documento US 4.188.318 y el documento de patente alemana DE 26 36 757.

Sin embargo, la pureza de un fibrinógeno, que se ha obtenido solamente sobre la base de unas precipitaciones, todavía no es suficiente para algunos usos, de tal manera que en el estado de la técnica se describen adicional o alternativamente diferentes etapas de adsorción y de cromatografía para la purificación de un fibrinógeno.

En el ámbito de la cromatografía por intercambio de iones se utiliza frecuentemente la cromatografía por intercambio de aniones. En este contexto se remite al documento EP 0 555 135, en el que un fibrinógeno es fijado en una etapa principal del procedimiento a una columna de intercambio de aniones, mientras que p.ej. una albúmina y unos agentes desactivadores no se fijan. El fibrinógeno se eluye a continuación a partir de la columna. En el documento WO 93/05067 se aprovecha la fijación de un fibrinógeno a intercambiadores de aniones, con el fin de eliminar de nuevo los detergentes que se han añadido para la desactivación de los virus. El documento WO 01/48016 describe la fijación de un fibrinógeno a un material de intercambio de iones mediando una utilización preferente de los waminoácidos que retardan la descomposición del fibrinógeno, tales como, por ejemplo, el ácido E-amino-caproico (EACA) , en el tampón de aplicación y/o de lavado. Una tal etapa de procedimiento hace posible en particular un empobrecimiento eficiente del plasminógeno contaminante a partir de soluciones que contienen fibrinógeno.

La cromatografía con un intercambiador de cationes encuentra uso, por ejemplo, en la purificación de un fibrinógeno a partir de la leche de animales transgénicos, que se ha descrito en el documento WO 00/17234. También en este caso se escogen unas condiciones, que tienen como consecuencia la fijación del fibrinógeno al material de la columna y por consiguiente hacen posible la separación de p.ej. caseína.

La propiedad de la fijación del fibrinógeno a los intercambiadores de cationes se aprovecha en el documento WO 91/01808, con el fin de eliminar selectivamente fibrinógeno, lipoproteínas y urea a partir de unos líquidos tales como p.ej. la sangre.

En el documento WO 89/12065 se purifica un fibrinógeno en una etapa de procedimiento mediante una columna con heparina-Sepharose. Las condiciones se escogen de tal manera que el fibrinógeno sea adsorbido junto al material de la columna, y que de esta manera se puedan separar sobre todo albúminas, inmunoglobulinas y sustancias desactivadoras de los virus.

También se describe la posibilidad de purificar un fibrinógeno por medio de interacciones hidrófobas. En el documento WO 00/17239 la purificación de un fibrinógeno a partir de la leche de animales transgénicos se consigue en una etapa de procedimiento mediante fijación a una columna hidrófoba, en presencia de sales, con una subsiguiente elución. Asimismo, se menciona la posibilidad del uso de una columna hidrófoba para un fibrinógeno procedente de un plasma humano. También se describen diferentes cromatografías por afinidad, que disponen de diferentes ligandos, que son capaces de fijar selectivamente a un fibrinógeno. En este contexto se ha de remitir p.ej. a los documentos US 6.037.457 o WO 99/05176, que describen unos anticuerpos, que fijan específicamente al fibrinógeno o a los péptidos del fibrinógeno, y que se pueden emplear, entre otras cuestiones, para la purificación de un fibrinógeno. Los documentos EP 0 789 030, US 5.723.579 y US 5.783.663 describen unos péptidos, que fijan a un fibrinógeno y que se pueden utilizar correspondientemente como ligandos en columnas de afinidad para la purificación de un fibrinógeno. Una ristocetina inmovilizada se empleó asimismo para la fijación de un fibrinógeno, y éste se eluyó de nuevo con urea 8 M (Suzuki y colaboradores, Thrombosis Research 18 (1980) 707-715) . En el documento WO 99/20655 se utiliza finalmente una trombina desactivada como ligando para substratos de trombina, entre los que se cuenta también un fibrinógeno. En el documento WO 90/12803 se describe la denominada IMAC (acrónimo de "Immobilized Metal Affinity Chromatography" = cromatografía por afinidad con metales inmovilizados) para la purificación de determinadas proteínas. También se expone un fibrinógeno humano como una posible proteína, que se fija a la matriz de un compuesto quelato metálico. El fibrinógeno se fija también a una protamina-agarosa y se puede eluir a continuación en un pH ácido, véase, por ejemplo, el documento US 6.037.457 o la cita bibliográfica de Dempfle & Heene (Thrombosis Research 46 (1987) 19-27) .

Todos/as estos/as procedimientos o etapas de procedimiento que se han expuesto tienen en común el hecho de que las condiciones se escogen de tal manera que un fibrinógeno se fije al material de cromatografía o respectivamente de adsorción, y a continuación, se tenga que desprender de nuevo desde el material en forma de gel.

Unos procedimientos, en los que un fibrinógeno pasa a través de la columna, se han descrito hasta ahora solamente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la purificación de unas soluciones que contienen fibrinógeno, caracterizado por que contiene una o varias etapas de procedimiento, en la (s) que se empobrece (n) una o varias proteínas contaminantes mediante una o varias cromatografías negativas y/o una o varias adsorciones negativas, en cada caso mediando utilización de un gel de un colorante, llevándose a cabo la cromatografía negativa y/o la adsorción negativa a un valor del pH comprendido entre 5, 5 y 9.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que como gel de un colorante se utiliza un gel de un colorante de color azul.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que como gel de un colorante se utiliza un gel de un colorante de color rojo o verde.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizado por que en el caso del gel de un colorante se trata de Blue Hyper D, Mimetic Blue Agarose, Mimetic Blue SA P6XL, Mimetic Blue 1 P6XL, Blue Trisacr y l Plus LS, Blue Uniflow, Blue Sepharose 6FF, Blue Sepharose CL 6B, Red Sepharose CL 6B, Fractogel TSK AF Green y/o Matrex gel Green A.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado por que el rendimiento de fibrinógeno en el material que ha pasado en la cromatografía negativa o en el material sobrenadante de la adsorción negativa es º 50 %, de manera preferida º 70 %.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado por que la etapa de procedimiento que contiene la adsorción o cromatografía negativa, se lleva a cabo en presencia de unas sustancias, que debilitan la fijación de plasminógeno a un fibrinógeno.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado por que como material de partida se utiliza una mezcla obtenida a partir de sangre, de una leche de animales transgénicos o del material sobrenadante de la fermentación o de una fracción producida a partir de éste.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que como material de partida se utiliza un plasma humano, una fracción de plasma o un material crioprecipitado.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 8, caracterizado por que están contenidas una o varias etapas de procedimiento, en las que se precipita un fibrinógeno.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que están contenidas una o varias precipitaciones con glicina o con otros aminoácidos.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 10, caracterizado por que están contenidas una o varias etapas de procedimiento, en las que se elimina el plasminógeno, a través de un material en forma de gel, con lisina o con compuestos análogos a la lisina como grupos funcionales.

12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizado por que están contenidas una o varias etapas de procedimiento para el empobrecimiento y/o la eliminación de partículas infecciosas.

13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 12, en el que se combinan las siguientes etapas de procedimiento: producción de una fracción de plasma, una adsorción junto a hidróxido de aluminio, una desactivación de partículas infecciosas tales como, por ejemplo, virus, una precipitación, otras etapas adicionales de purificación y/o desactivación, una cromatografía negativa y/o una adsorción negativa, una ultrafiltración y una filtración en condiciones estériles.