Proteínas quiméricas aisladas de lumazina sintetasa modificada.

Proteína quimérica aislada que consiste en un péptido, un polipéptido o un dominio proteicoligado covalentemente a una proteína lumazina sintetasa modificada de Brucella spp.

, en dondelos primeros 8 residuos de aminoácidos N-terminales han sido eliminados y el noveno Asn (N) hasido reemplazado por Leu (L).

Proteínas quiméricas aisladas de lumazina sintetasa modificada Proteínas quiméricas aisladas que incluyen hasta diez copias de péptidos, polipéptidos o dominios proteicos insertados en los extremos amino terminales de la enzima lumazina sintetasa de Brucella spp. Secuencias aisladas de nucleótidos que codifican las proteínas quiméricas. Vectores, plásmidos y células transformadas utilizados para expresar las proteínas. Anticuerpos monoclonales y policlonales inducidos por las proteínas quiméricas. Hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales. Vacunas y compuestos farmacéuticos que incluyen las proteínas quiméricas, secuencias de nucleótidos y anticuerpos. Un metódo para inducir una respuesta inmune en organismos superiores que incluye la administración de cantidades efectivas de las vacunas y compuestos farmacéuticos. Biosensores que incluyen las proteínas quiméricas. Conjugados proteicos formados por las proteínas quiméricas y un ligando unidos mediante enlaces covalentes y no covalentes. Usos de las proteínas quiméricas, secuencias de nucleótidos, vectores, plásmidos, células transformadas, anticuerpos, hibridomas, conjugados, biosensores, vacunas y composiciones farmacéuticas. La estructura cuaternaria de las proteínas quiméricas.

La presente invención se refiere a proteínas quiméricas formadas por proteínas modificadas derivadas de la enzima lumazina sintetasa de Brucella spp., ligadas a péptidos, polipéptidos o dominios proteicos. Las proteínas quiméricas son útiles para la inducción de respuestas inmunes en animales superiores y para otros propósitos. La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que incluyen antígenos o anticuerpos, o segmentos de antígenos o anticuerpos, unidos a las proteínas modificadas.

La aplicación masiva de vacunas atenuadas vivas ofrece varios inconvenientes económicos y sanitarios. Por ejemplo, la atenuación de vacunas vivas a menudo disminuye la inmunogenicidad de las mismas. Ver Leclerc, et al., Immunol. Today, 19 (7) :300-302, (1998) ; Nieba, et al., Mod. Asp. Immunobiol., 1 (2) :36-39 (2000) . Otro inconveniente es la posibilidad de que la atenuación se revierta y que el microorganismo recupere sus propiedades de inducción de la enfermedad. Ver Redfield, N., N. Eng. J. Med., 316:673-678 (1998) . Es por ello que en los últimos años se ha tendido a formular vacunas acelulares, basadas en compuestos individuales aislados de bacterias o virus. En general, estos compuestos individuales, como proteínas características de un microorganismo, poseen baja inmunogenicidad. Esta limitación ha sido superada mediante el uso de sustancias adyuvantes. Sin embargo, existen proteínas que aún en presencia de sustancias adyuvantes continúan mostrando baja inmunogenicidad. Varias estrategias de ingeniería de proteínas han sido propuestas para superar estas dificultades. Ver Leclerc, et al., Immunol. Today, 19 (7) :300-302 (1998) .

Las proteínas de cápside virales son capaces de formar partículas ordenadas tridimensionalmente, las llamadas “partículas tipo virus”. Estas partículas tienen el mismo tamaño y forma que los virus enteros. Sin embargo, se encuentran vacías en su interior y sin el material genético dejándolas incapaces de producir infección. Su gran tamaño y orden les otorga una marcada inmunogenicidad. Ver Bachmann, et al., Science, 262:1448-1451 (1993) . La vacuna recombinante contra la hepatitis B, de amplia aceptación en el mercado, se fundamenta en este concepto. Las “partículas tipo virus” han sido utilizadas como un vehículo para la inserción de péptidos característicos de ciertos patógenos con el objeto de producir vacunas contra dichos microorganismos patogénicos. Ver WO0032227 (Renner, et al.) ; WO0185208 (Bachmann, et al.) . Una estrategia favorita ha sido la inserción de copias múltiples de un péptido en un vehículo muy inmunogénico de por sí, a fin de proveer al péptido de carácter adyuvante del vehículo. Sin embargo, este acercamiento ha encontrado muchas dificultades: debido al gran tamaño de estas partículas, cualquier inserción de un péptido en su proteína componente obstruye su propio plegamiento, y en muchos casos disminuye su estabilidad. Además, son pocos los sitios de la proteína que son capaces de aceptar inserciones de péptidos sin cambiar su estructura general. Ver Nieba, et al. Mod. Asp. Immunobiol., 1 (2) :36-39 (2000) .

Algunas proteínas bacterianas han sido postuladas como vehículos para el desarrollo de vacunas quiméricas. Ver Leclerc, et al., Immunol. Today, 19 (7) :300-302 (1998) . La subunidad B de la toxina colérica es una proteína pentamérica estable que ha sido utilizada para obtener respuesta inmune de mucosas contra péptidos insertados. Esta estrategia ha sido exitosa debido a la capacidad de toxina para penetrar por la mucosa gástrica. Ver Arakawa, et al. Nature Biotech., 16:934-938 (1998) . La enzima dihidrolipoil deshidrogenasa de Bacillus steearothermophilus también ha sido postulada como vehículo proteico debido a que forma una estructura polimérica compleja y muy estable. Ver Domingo, et al., J. Mol. Biol., 305:259-267 (2001) ; WO0142439 (Domingo, et al.) .

La enzima lumazina sintetasa cataliza el anteúltimo paso en la vía biosintética de la riboflavina. Ver Goldbaum, et al.,

J. Med. Microbiol., 48:833-839 (1999) . Su sitio activo se encuentra en la interfase entre monómeros, haciendo que esta proteína adquiera un ordenamiento polimérico muy estable. Ver Ritsert, et al. J. Mol. Biol., 253:151-167 (1995) . Estos ordenamientos varían entre proteínas que forman partículas pentaméricas e icosahédricas. Ver Braden, et al.,

J. Mol. Biol., 297:1031-1036 (2000) . La estructura icosahédrica de la lumazina sintetasa de B. subtilis ha sido propuesta como un vehículo para la inserción de péptidos y el desarrollo de vacunas. Ver WO0053229 (Bacher, et al.) .

La lumazina sintetasa de Brucella spp. es una proteína altamente estable. Se ha demostrado que esta proteína de 18 kDa es un marcador útil para el diagnóstico serológico de brucelosis humana y animal. Ver Goldbaum, et al., J. Clin. Microbiol., 30:604-607 (1992) ; Goldbaum, et al., J. Clin. Microbiol., 31:2141-2145 (1993) ; Baldi, et al., Clin. Diag. Lab. Immunol., 3 (4) :472-476 (1996) . De acuerdo a estudios inmunoquímicos, de función enzimática y de estructura tridimensional por cristalografía de rayos X la proteína original sin modificar muestra el mismo plegamiento cuando es expresada en forma recombinante como la proteína salvaje. Ver Braden, et al. J. Mol. Biol., 297:1031-1036 (2000) ; Goldbaum, et al., J. Med. Microbiol., 48:833-839 (1999) ; Goldbaum, et al., J. Struct. Biol., 123:175-178 (1998) . La estructura muestra que esta proteína de 18 kDa se comporta como un decámero de 180 kDa en solución, constituyéndose en un nuevo tipo de arreglo cuaternario de lumazina sintetasa. Ver Zylberman, et al., J. Biol. Chem., 279 (9) :8093-8101 (2004) .

Se ha postulado que la inmunogenicidad de la lumazina sintetasa de Brucella spp. se debe fundamentalmente a su característica polimérica. Ver Baldi, et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 33:741-747 (2000) . La estructura también muestra que el extremo amino terminal de 10 aminoácidos no participa en el plegamiento general ni en los contactos entre monómeros. Ver Braden, et al. J. Mol. Biol., 297:1031-1036 (2000) . La lumazina sintetasa de Brucella spp. es un inmunógeno potente, capaz de producir una alta respuesta inmune humoral y celular en el modelo murino. Esta capacidad ha sido verificada cuando la inmunización es inducida con la proteína recombinante no modificada, y con un plásmido que codifica para la proteína (terapia génica, vacunación con ADN) . Ver Velikovsky, et al., J. Immunol. Meth., 244 (1-2) :1-7 (2000) . Es posible modular la respuesta cambiando la vía de inmunización y el adyuvante utilizado. Ver Velikovsky, et al., Infec. Immun., 70 (5) :2507-11 (2002) . En particular, es posible generar una fuerte respuesta de tipo TH1, que sería la respuesta de mayor capacidad protectora en brucelosis. Ver Velikovsky, et al. Infec. Immun., 70 (5) :2507-11 (2002) .

Velikowsky, et al. Infection and Immunity, 71 (10) , Oct.2003, p. 5750-5755 describe eficacia immunogénica y protectiva de la lumazina sintetasa recombinante de Brucella ssp. en ratones.

Toledo et al. Infection and Immunity, 69 (3) , Mar.2001, p.1766-1773 describe antígenos recombinantes KETc1 y KETc12 compartidos por Taenia crassiceps y Taenia solium, mejorando la inmunoprotección en contra de la cisticercosis experimental por T. crassiceps.

Dichaine et al. (Molecular and Cellular Biology, American Society for microbiology, Washington US, vol.20 (15) , Aug.2000, p.5592-5601 describe las proteínas... [Seguir leyendo]

1. Proteína quimérica aislada que consiste en un péptido, un polipéptido o un dominio proteico ligado covalentemente a una proteína lumazina sintetasa modificada de Brucella spp., en donde los primeros 8 residuos de aminoácidos N-terminales han sido eliminados y el noveno Asn (N) ha sido reemplazado por Leu (L) .

2. Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína modificada consiste en SEQ ID NO:7a.

3. Secuencias de nucleótidos aisladas que comprenden las secuencias codificantes para las proteínas quiméricas y modificadas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde las secuencias de nucleótidos codificantes para los primeros 8 residuos N-terminales de la proteína modificada comprenden sitios de restricción para las enzimas Nsi y Afl II.

4. Las secuencias de ADN aisladas, de acuerdo con la reivindicación 3, que consisten en las secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:1b, SEQ ID NO:2b, SEQ ID NO:3b, SEQ ID NO:4b, SEQ ID NO:5b, SEQ ID NO:6b, SEQ ID NO:7b, SEQ ID N0:9b, SEQ ID NO:10b y SEQ ID NO:11b.

5. Vectores utilizados como un vehículo que comprenden las secuencias de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4.

6. Los vectores, de acuerdo con la reivindicación 5, en donde los vectores son virales o plasmídicos.

7. Vectores de acuerdo con la reivindicación 5, siendo el plásmido de SEQ ID NO:9c.

8. Los vectores plasmídicos, de acuerdo con la reivindicación 6, siendo el plásmido pBLS-OMP31, número de depósito DSM 15546.

9. Células transformadas con los vectores de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.

10. Células transformadas de acuerdo con la reivindicación 9, en donde las células son células Eucariotas o Procariotas.

11. Células transformadas, de acuerdo con la reivindicación 9, siendo células de Escherichia coli

12. Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido, polipéptido o dominio proteico ligado es un antígeno, toxina, agente o segmento de los mismos, capaz de inducir una respuesta inmune en un organismo Eucariota.

13. Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el antígeno es OMP-31, KET C1 o RBD3 o segmento de OMP-31, KET C 1 o RBD3.

14. Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 13, que tienen la secuencia SEQ ID NO:9a.

15. Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 13, que tienen la secuencia SEQ ID NO:10a.

16. Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 13, que tienen la secuencia SEQ ID NO:11a.

17. Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la respuesta inmune es humoral o celular.

18. Las proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el organismo Eucariota es de especie mamífera tal como especie murina, conejuna o humana.

19. La combinación de dos o más proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los dominios peptídicos, polipeptídicos o protéicos ligados a cada proteína modificada es diferente.

20. La combinación de dos o más proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los dominios peptídicos, polipeptídicos o protéicos ligados a cada proteína modificada es idéntico.

21. Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

22. Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende un excipiente farmacéutico aceptable.

23. Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el excipiente farmacéutico aceptable es un adyuvante.

24. Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el adyuvante consiste de un adyuvante de Freund, un dipéptido MDP, saponina, estearato de tirosina, hidróxido de aluminio, citoquinas linfáticas, la proteína salvaje de lumazina sintetasa de Brucella spp o las proteínas modificadas de lumazina sintetasa de Brucella spp.

25. Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-4.

26. Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende un excipiente farmacéutico aceptable.

27. Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el excipiente farmacéutico aceptable es un adyuvante.

28. Una composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el adyuvante consiste de un adyuvante de Freund, un dipéptido MDP, saponina, estearato de tirosina, hidróxido de aluminio, citoquinas linfáticas, la proteína salvaje de lumazina sintetasa de Brucella spp o las proteínas modificadas de lumazina sintetasa de Brucella spp.

29. Una composición farmacéutica que comprende al menos una de las proteínas quiméricas aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y al menos una de las secuencias de nucleótidos aisladas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-4.

30. Una composición farmacéutica, de acuerdo con las reivindicaciones 23 o 27, para uso en inducción de una respuesta inmune en un organismo Eucariota.

31. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la respuesta inmune es humoral

o celular.

32. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la composición farmacéutica es para ser administrada de manera simultánea o secuencial.

33. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el organismo Eucariota es de especie mamífera tal como una especie murina, conejuna o humana.

34. Una composición, de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la composición farmacéutica es para ser administrada por vía subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, oral o nasal o mediante un sistema de inyección sin aguja.

35. Un biosensor que comprende: (a) un soporte donde se fija al menos una proteína quimérica aislada de acuerdo con la reivindicación 1 y (b) dicho soporte está conectado a medios de medición que permiten determinar si un ligando se ha unido a, o reaccionado con, la proteína quimérica aislada.

36. Un biosensor, de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el ligando es un anticuerpo.

37. Conjugados de proteína que comprenden un ligando ligado al péptido, polipéptido o dominio proteico conectado a las proteínas modificadas de lumazina sintetasa de Brucella spp. de acuerdo con la reivindicación 1.

38. Conjugados de proteína, de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el enlace es un enlace covalente, tal como un enlace peptídico.

39. Conjugados de proteína, de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el enlace es no covalente.

40. Conjugados de proteína, de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el ligando y la proteína quimérica están enlazados mediante secuencias conectoras de un dominio de heterodimerización, tal como secuencias que codifican para zipper de leucina.

41. Proteínas quiméricas aisladas, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde su estructura cuaternaria es un decámero.