Proteínas de fusión antiapoptóticas.

Proteína de fusión, que comprende

(a) un dominio de transducción de proteína capaz de introducir la proteína de fusión en una célula de mamífero;

(b) una proteína antiapoptótica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o una varianteantiapoptóticamente activa de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que tiene al menos 70% de identidad deaminoácidos con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento antiapoptóticamente activo de la secuencia de laSEQ ID NO: 1 o de la variante definida aquí de la SEQ ID NO: 1.

Proteínas de fusión antiapoptóticas La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende un dominio de transducción de la proteína capaz de introducir la proteína de fusión en una célula de mamífero y una proteína antiapoptótica que comprende el aminoácido de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o una variante antiapoptóticamente activa de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que tiene al menos 70% de identidad de aminoácidos con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento antiapoptóticamente activo de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o de la variante definida aquí de la SEQ ID NO: 1. La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende dicha proteína de fusión, en particular para el bloqueo de la apoptosis en un paciente que requiera del mismo. La invención también proporciona un polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión, un vector de expresión que comprende el polinucleótido y una célula huésped que comprende el vector de expresión. En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de cualquiera de estos materiales para la preparación de un medicamento para el bloqueo de la apoptosis en un paciente que requiera del mismo.

Antecedentes de la invención La regulación del número de células en organismos multicelulares es un requisito esencial tanto para el desarrollo del organismo como para el mantenimiento de sus diferentes funciones vitales. La apoptosis es un proceso mediante el cual las células que no son necesarias en una cierta etapa de desarrollo experimentan una muerte celular programada. Por ejemplo, es la interacción regulada en forma precisa de la proliferación y la apoptosis la que es responsable de formar tejidos y órganos en el embrión en desarrollo. La apoptosis es inducida por una variedad de diferentes estímulos y propagada por diferentes vías.

La vía extrínseca entre otras cosas incluye la unión de los ligandos del receptor de muerte, por ejemplo, TNF, TRAIL y CD95L, a sus respectivas moléculas receptoras en la célula, en donde la unión activa en última instancia la caspasa-8. La vía intrínseca es estimulada, por ejemplo, a través de la aplicación de los inhibidores de la topoisomerasa que daña el ADN, doxorrubicina, etopósido y estaurosporina, estimulación del TCR, irradiación UV, daños en el ADN y similares, lo que resulta en la liberación de citocromo c de la mitocondria, la activación de la caspasa-9, y la ruta dependiente de la granzima B para la activación de la caspasa. La granzima B puede procesar BID así como la caspasa-3 y -7 para iniciar la apoptosis. Estas vías están relacionadas de tal manera que se afectan entre sí. Las células que sufren la apoptosis regularmente muestran una cantidad de rasgos característicos, tales como condensación de la cromatina, encogimiento celular, aumento de la permeabilidad de la membrana y escisión de ADN internucleosomal.

Además de sus diferentes funciones durante el desarrollo, una apoptosis alterada, aumentada o defectuosa también está implicada en una cantidad de enfermedades o condiciones patológicas. Por ejemplo, la isquemia y posterior reperfusión inducen la apoptosis tanto a través de la vía intrínseca como de la extrínseca lo que puede conducir a un fallo completo de tejidos u órganos cruciales cuya función es esencial para el organismo. Por ejemplo, un nivel anormalmente mayor de apoptosis puede dar lugar a insuficiencia renal y daño del tejido cerebral. Además, se ha reportado que un aumento de la apoptosis también está implicado en trastornos gastrointestinales. Por el contrario, una apoptosis anormalmente menor está implicada en diferentes formas de cáncer.

A pesar de que se han sugerido diferentes inhibidores de apoptosis en el estado del arte, ninguno de estos enfoques ha demostrado ser adecuado para la práctica clínica. Por ejemplo, se han discutido diferentes proteínas antiapoptóticas como compuestos terapéuticos. Sin embargo, el uso clínico de estas proteínas es en la actualidad únicamente posible mediante el uso de métodos de transferencia génica que implican riesgos imprevisibles para los pacientes sometidos a tal tratamiento. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar medios para un tratamiento seguro y eficiente de una apoptosis anormalmente aumentada. Este objetivo se consigue mediante una proteína de fusión que comprende un dominio de transducción de la proteína capaz de introducir la proteína de fusión en una célula de mamífero y una proteína antiapoptótica como se define adicionalmente en este documento.

El arte previo incluye J. Biol. Chem., 279, 2004, 44005 - 55011 que divulga HIV-TAT como una proteína de fusión con FLIP, donde la primera permite que la segunda cruce la membrana celular, la segunda inhibe la iniciación de la apoptosis mediada por el receptor de muerte; J. Biol. Chem., 270, 1995, 22705 - 8 que divulga la proteína CrmA, y su efecto sobre la inhibición de la citólisis mediada por CTL; y J. Biol. Chem., 270, 1995, 3255 - 3260, que divulga la proteína CrmA, y los efectos de la misma en la inhibición de apoptosis inducida por citoquina.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los resultados de ensayos in vitro que demuestran que TAT-CrmA es capaz de bloquear la actividad de la caspasa-3, un marcador temprano de las células que experimentan apoptosis. Los lisados se derivaron a partir de células Jurkat no tratadas (A) , células Jurkat tratadas con anticuerpo anti-Fas (B) o células Jurkat tratadas con TAT-CrmA antes de la adición de anticuerpo anti-Fas (C) .

La Figura 2 muestra la determinación de la apoptosis tal como se mide por el cambio en el potencial de membrana. El tratamiento de las células con proteína de fusión TAT-CrmA antes de la adición de Estaurosporina o anticuerpo anti-Fas, respectivamente, parcialmente anula la pérdida del potencial de membrana en las células inducidas por estos dos estímulos.

La Figura 3 muestra la detección de la apoptosis por análisis FACS utilizando Anexina V marcada con FITC en células Jurkat que se incubaron con TAT-CrmA y anticuerpo anti-Fas (A) , en células Jurkat no tratadas (B) o en células Jurkat que se incubaron únicamente con anticuerpo anti-Fas (C) . El número de células que experimentan apoptosis se reduce significativamente en las reacciones que utilizan TAT-CrmA en comparación con reacciones que utilizan sólo anticuerpo anti-Fas.

La Figura 4 describe los resultados de los estudios in vivo en ratones utilizando la proteína de fusión TAT-CrmA. La proteína de fusión protege efectivamente los ratones de la apoptosis mediada por Fas in vivo.

La Figura 5 describe los resultados de estudios in vivo en ratones que recibieron la proteína de fusión TAT-CrmA. La proteína de fusión protege efectivamente los ratones de apoptosis inducida por doxorrubicina in vivo.

La Figura 6 muestra una comparación de tamaños de infartos después de reperfusión de acuerdo a lo determinado por azul de Evans y coloración con TTC.

De acuerdo con la presente invención, sorprendentemente se ha encontrado ahora que el acoplamiento de la proteína modificadora A de la respuesta a citoquinas (CrmA) del virus de la viruela de las vacas a un dominio de transducción de proteína, tal como el dominio de transducción de proteína de la proteína Tat del VIH, da como resultado una proteína de fusión activa antiapoptóticamente activo que sea efectiva en el bloqueo de la apoptosis en un paciente que requiera de un tratamiento antiapoptótico, es decir, un paciente que sufra de una enfermedad caracterizada por un nivel patógeno de apoptosis en las células o tejidos del organismo.

En consecuencia, se proporciona una proteína de fusión, comprendiendo dicha proteína de fusión al menos los siguientes componentes:

(a) un dominio de transducción de la proteína capaz de introducir la proteína de fusión en una célula de mamífero;

(b) una proteína antiapoptótica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o una variante antiapoptóticamente activa de la SEQ ID NO: 1 que tiene al menos 70% de identidad de aminoácidos con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento antiapoptóticamente activo de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o de la variante definida aquí de la SEQ ID NO: 1.

El uso de las proteínas o polipéptidos terapéuticamente activos se vio impedido durante mucho tiempo por la incapacidad de estas proteínas o polipéptidos para cruzar la barrera de la membrana celular. El descubrimiento de los dominios de transducción de proteínas (PTD) al igual que a partir de la proteína Tat del VIH que actúan como moléculas de transporte facilitaron la transducción de las grandes proteínas o... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión, que comprende

(a) un dominio de transducción de proteína capaz de introducir la proteína de fusión en una célula de mamífero;

(b) una proteína antiapoptótica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o una variante antiapoptóticamente activa de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 que tiene al menos 70% de identidad de aminoácidos con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento antiapoptóticamente activo de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o de la variante definida aquí de la SEQ ID NO: 1.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de transducción de proteína se deriva del dominio de transducción de la proteína Tat del virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en donde dicho dominio de transducción de proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad con la misma.

4. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en donde la proteína de fusión comprende además un enlazador entre el dominio de transducción de la proteína y la proteína antiapoptótica.

5. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4 para uso en un método de tratamiento de una lesión por reperfusión o infarto de miocardio.

6. Composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4.

7. Composición farmacéutica de la reivindicación 6 para uso en un método de tratamiento de una lesión por reperfusión o infarto de miocardio.

8. Polinucleótido que codifica una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4.

9. Vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.

10. Célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8 o el vector de expresión de la reivindicación 9.

11. Método para la preparación de la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 10 bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína de fusión.

12. El uso de la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, el polinucleótido de la reivindicación 8, el vector de expresión de la reivindicación 9, o la célula huésped de la reivindicación 10 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una lesión por reperfusión o un infarto del miocardio.

13. Kit que comprende la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, el polinucleótido de la reivindicación 8, el vector de expresión de la reivindicación 9, y/o la célula huésped de la reivindicación 10.