Procedimientos y aparato para reacciones de amplificación secuenciales.

Un procedimiento de determinación de la presencia o ausencia de una pluralidad de diferentespolinucleótidos diana en una muestra realizando amplificaciones sucesivas de diferentes polinucleótidos dediferentes partes de la muestra,

comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(i) suministro de una cámara de reacción selectivamente en comunicación fluida con un depósito de residuos, undepósito de muestras que contiene una muestra, un primer depósito de reactivos que contiene primeros reactivos deamplificación y un segundo depósito de reactivos que contiene segundos reactivos de amplificación;

(ii) combinación de una primera parte de la muestra y los primeros reactivos de amplificación para formar unaprimera mezcla de reacción;

(iii) sometimiento de la primera mezcla de reacción a condiciones de reacción de amplificación en la cámara dereacción para producir un primer amplicón de uno o más polinucleótidos diana siempre que dichos polinucleótidosestén presentes en la muestra;

(iv) transferencia fluida de la primera mezcla de reacción al depósito de residuos;

(v) combinación de una segunda parte de la muestra y los segundos reactivos de amplificación para formar unasegunda mezcla de reacción; y

(vi) sometimiento de la segunda mezcla de reacción a condiciones de reacción de amplificación en la cámara dereacción para producir un segundo amplicón de uno o más polinucleótidos diana siempre que dichos polinucleótidosestén presentes en la muestra, en el que la detección de los amplicones primero y segundo determina la presencia oausencia de la pluralidad de diferentes polinucleótidos diana en la muestra.

Procedimientos y aparato para reacciones de amplificación secuenciales REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud es una continuación de la solicitud de EE.UU. nº 11/742.028, presentada el 30 de abril de 2007, que reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/796.804 presentada el 1 de mayo de 2006.

DECLARACIÓN DE DERECHOS A LAS INVENCIONES REALIZADAS SEGÚN INVESTIGACIÓN O DESARROLLO CON PATROCINIO FEDERAL

NO APLICABLE

REFERENCIA A UN APÉNDICE DE UN "LISTADO DE SECUENCIAS”, UNA TABLA O UN LISTADO DE PROGRAMA INFORMÁTICO REMITIDO EN UN DISCO COMPACTO.

NO APLICABLE

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere en general a procedimientos para analizar en una muestra la presencia de uno o más ácidos nucleicos, y más en particular, a procedimientos para realizar reacciones de amplificación de ácidos nucleicos de etapas múltiples, especialmente reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La amplificación de ácidos nucleicos es un componente crucial de muchas técnicas usadas en la investigación, la medicina y la industria. Dichas reacciones se usan en investigación clínica y biológica, detección y vigilancia de enfermedades infecciosas, detección de mutaciones, detección de marcadores cancerosos, vigilancia ambiental, identificación genética, detección de agentes patógenos en aplicaciones de biodefensa, y similares, por ejemplo, Schweitzer y col. Current Opinion in Biotechnology, 12:21-27 (2001) ; Koch, Nature Reviews Drug Discover y , 3:749-761 (2004) . En particular, las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) han encontrado aplicaciones en todos estos campos, incluidas aplicaciones para detección vírica y bacteriana, observación de la carga viral, detección de patógenos raros y/o difíciles de cultivar, detección rápida de amenazas bioterroristas, detección de enfermedad residual mínima en pacientes de cáncer, pruebas de patógenos en los alimentos, cribado de riego sanguíneo, y similares, por ejemplo, Mackay, Clin. Microbiol. Infect., 10: 190-212 (2004) ; Bernard y col. Clinical Chemistr y , 48:1178-1185 (2002) . En lo que respecta a PCR, los motivos principales para este uso tan extenso son su velocidad y facilidad de uso (realizada normalmente en unas horas mediante el uso de kits estandarizados e instrumentos relativamente sencillos y de bajo coste) , su sensibilidad (a menudo pueden detectarse varias decenas de copias de una secuencia diana en una muestra) y su robustez (las muestras de baja calidad o muestras conservadas, por ejemplo, muestras forenses o muestras de tejido fijado, son fáciles de analizar) , Strachan y Read, Human Molecular Genetics 2ª Ed. (John Wiley & Sons, Nueva York, 1999) .

Debido a estas ventajas, se ha suscitado interés por extender las técnicas de amplificación con el fin de dar cabida a múltiples polinucleótidos diana a partir de la misma muestra biológica. Se han adoptado varios enfoques, entre ellos: (i) realización simultáneamente de múltiples amplificaciones en una sola reacción, como PCR múltiplex, descrita por ejemplo, en Caskey y col., patente de EE.UU. 5.582.989; Elnifro y col., Clinical Microbiology Reviews, 13:559-570 (2000) ; Henegariu y col. Biotechniques, 23:504-511 (1997) ; (ii) realización en secuencia de múltiples amplificaciones en una sola reacción mediante ajustes de compromiso en las condiciones de reacción para favorecer diferentes reactivos, por ejemplo, Raja y col. Clinical Chemistr y , 48:1329-1337 (2002) ; y (iii) distribución en partes alícuotas de partes de una muestra en varias cámaras de reacción para amplificaciones separadas, usando a menudo un dispositivo de microfluídica, descrito por ejemplo, en Cottingham, patente de EE.UU. 5.948.673; Mamaro y col., patente de EE.UU. 6.605.451; Enzelberger y col., patente de EE.UU. 6.960.437; Liu y col. Anal. Chem., 75:4718-4723 (2003) ; Woudenberg y col., patente de EE.UU. 6.126.899; Gulliksen y col., Anal. Chem., 76:9-14 (2004) ; Anderson y col., patente de EE.UU. 6.168.948; y similares. El primer enfoque ha mostrado ser difícil de implementar de forma rutinaria debido a la dificultad de encontrar condiciones de reacción en virtud de las cuales todos los reactivos, por ejemplo, diferentes cebadores y secuencias diana, se amplifiquen aproximadamente en las mismas tasas. El segundo enfoque tuvo cierto éxito sobre todo cuando se requiere una amplificación rápida de pocas secuencias de abundancias ampliamente variables; sin embargo, existen importantes restricciones en los parámetros de reacción disponibles para su manipulación con el fin de obtener amplificación preferente de diferentes secuencias. El tercer enfoque ofrece el potencial de permitir que se realicen múltiples reacciones de amplificación en muestras únicas; sin embargo, los dispositivos microfluídicos son en general difíciles de fabricar y requieren sistemas de válvulas y redes de distribución de fluidos complejos que han impedido su aplicación extensa.

Por otra parte, en ciertas aplicaciones, dicha prueba de muestras intraoperación, y prueba de agentes infecciosos y de biodefensa, es importante emplear condiciones de reacción cerradas a los fluidos con el fin de reducir al mínimo la ocurrencia de valoraciones de falsos positivos. Los enfoques anteriores para analizar múltiples polinucleótidos diana introducen cada uno un nivel de dificultad ya sea al imponer compromisos en la elección de las condiciones de reacción, por ejemplo, un conjunto óptimo de condiciones para una reacción en su conjunto puede no ser óptimo para dianas individuales, o al requerir acceso a una reacción después de que se haya iniciado o empleando múltiples puertos para introducir la muestra, multiplicando con ello las posibilidades de contaminación, o problemas similares.

A la vista de estos problemas, sería muy útil en las aplicaciones que requieren una amplificación rápida de múltiples secuencias si se dispusiera de procedimientos adicionales para dichas operaciones que no tuvieran los inconvenientes de las tecnologías actuales.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para realizar múltiples reacciones de amplificación en una sola cámara de reacción mediante ciclos sucesivos de carga de la mezcla de reacción, amplificación y retirada de la mezcla de reacción gastada en un sistema de reacción cerrado a los fluidos. En particular, las formas de realización de la presente invención permiten la amplificación de una pluralidad de diferentes polinucleótidos diana a partir de una sola muestra realizando amplificaciones sucesivas de diferentes polinucleótidos diana de diferentes partes de la muestra.

La invención proporciona un procedimiento según la reivindicación 1.

En el procedimiento de la invención puede usarse un sistema de reacción cerrado a los fluidos, comprendiendo el sistema de reacción cerrado a los fluidos para realizar múltiples reacciones de amplificación secuenciales: (i) una cámara de reacción selectivamente en comunicación fluida con un depósito de muestras, un depósito de residuos y una pluralidad de depósitos de reactivos que contienen diferentes reactivos de amplificación, estando cada uno de los depósitos cerrados a los fluidos; y (ii) una bomba asociada operativamente con una válvula rotatoria para realizar ciclos repetidos de (a) transferencia fluida de una parte de una muestra desde el depósito de muestras y reactivos de amplificación de al menos uno de los depósitos de reactivos a la cámara de reacción, en el que tiene lugar una reacción de amplificación para formar uno o más amplicones en una mezcla de reacción; (b) retirada de la mezcla de reacción desde la cámara de reacción y transferencia fluida de la misma al depósito de residuos después de que se detectan uno o más amplicones.

En el procedimiento de la invención puede usarse un producto legible por ordenador que comprende un programa ejecutable con ordenador para controlar el rendimiento de una pluralidad de reacciones de amplificación secuenciales. El programa comprende instrucciones para: (a) leer valores de una señal óptica a partir de una cámara de reacción de amplificación, en que la señal es el valor más reciente de una señal óptica relacionada monótonamente con la concentración de un amplicón en la reacción de amplificación; (b) determinar un nivel de señal de base a partir de los valores de la señal óptica; (c) cálculo de un valor predeterminado a partir de los valores de la señal óptica; (d) comparación del valor predeterminado con el valor más reciente de la señal óptica; y

(e) repetición de la etapa (d) hasta que el valor más reciente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de determinación de la presencia o ausencia de una pluralidad de diferentes polinucleótidos diana en una muestra realizando amplificaciones sucesivas de diferentes polinucleótidos de diferentes partes de la muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(i) suministro de una cámara de reacción selectivamente en comunicación fluida con un depósito de residuos, un depósito de muestras que contiene una muestra, un primer depósito de reactivos que contiene primeros reactivos de amplificación y un segundo depósito de reactivos que contiene segundos reactivos de amplificación;

(ii) combinación de una primera parte de la muestra y los primeros reactivos de amplificación para formar una primera mezcla de reacción;

(iii) sometimiento de la primera mezcla de reacción a condiciones de reacción de amplificación en la cámara de reacción para producir un primer amplicón de uno o más polinucleótidos diana siempre que dichos polinucleótidos estén presentes en la muestra;

(iv) transferencia fluida de la primera mezcla de reacción al depósito de residuos;

(v) combinación de una segunda parte de la muestra y los segundos reactivos de amplificación para formar una segunda mezcla de reacción; y

(vi) sometimiento de la segunda mezcla de reacción a condiciones de reacción de amplificación en la cámara de reacción para producir un segundo amplicón de uno o más polinucleótidos diana siempre que dichos polinucleótidos estén presentes en la muestra, en el que la detección de los amplicones primero y segundo determina la presencia o ausencia de la pluralidad de diferentes polinucleótidos diana en la muestra.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, que incluye además una etapa de deslavado de la cámara de reacción después de la etapa de transferencia fluida de la primera mezcla de reacción al depósito de residuos.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de transferencia fluida de la primera mezcla de reacción al depósito de residuos incluye las etapas de: (i) vigilancia de una señal óptica de un indicador en la primera mezcla de reacción, estando relacionada la señal óptica con una cantidad de un amplicón de al menos uno de los polinucleótidos diana o de un patrón interno en la primera mezcla de reacción; y (ii) transferencia fluida automáticamente de la primera mezcla de reacción desde la cámara de reacción al depósito de residuos siempre que la señal óptica alcance o supere un nivel predeterminado.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, que comprende además las etapas consistentes en transferir aire en la cámara de reacción y calentar la cámara de reacción a una temperatura de desnaturalización de ADN después de la etapa de transferencia fluida de la primera mezcla de reacción al depósito de residuos.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha temperatura de desnaturalización de ADN está en el intervalo de 85 a 100°C.

6. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha temperatura de desnaturalización de ADN está en el intervalo de aproximadamente 90°C a 99°C y en el que después de la etapa de calentamiento, la cámara de reacción se enfría a una temperatura de renaturalización de ADN.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de combinación de la primera parte de la muestra y los primeros reactivos de amplificación incluye la transferencia fluida de la primera parte de la muestra al primer depósito de reactivos para formar la primera mezcla de reacción y la transferencia fluida de la primera mezcla de reacción desde el primer depósito de reactivos a la cámara de reacción.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que la etapa de combinación de la segunda parte de la muestra y los segundos reactivos de amplificación incluye la transferencia fluida de la segunda parte de la muestra al segundo depósito de reactivos para formar la segunda mezcla de reacción y la transferencia fluida de la segunda mezcla de reacción desde el segundo depósito de reactivos a la cámara de reacción.

9. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que cada una de las reacciones de amplificación es una reacción en cadena de la polimerasa.

10. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra comprende un microorganismo.

11. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la reacción de amplificación es una cualquiera entre: una reacción en cadena de la polimerasa, una reacción lineal de la polimerasa, una reacción en cadena de la ligasa, una reacción de desplazamiento de cadena, una amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos y

una reacción de amplificación por círculo rodante.

12. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que la señal óptica se selecciona entre el grupo que consiste en una señal fluorescente, una señal quimioluminiscente, una señal electroquimioluminiscente y una señal colorimétrica.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que la señal óptica es una señal óptica fluorescente generada por un indicador fluorescente.