Reacciones de amplificación de ácido nucleico de múltiples estadios en sistema cerrado.

Un método para realizar una reacción de amplificación anidada,

comprendiendo el método las etapas de:

a) realizar una reacción de amplificación de primer estadio en una cámara de reacción de un sistema cerrado de forma fluida, comprendiendo la reacción de amplificación de primer estadio uno o más polinucleótidos diana de una muestra usando reactivos de amplificación de primer estadio en una primera mezcla de reacción para formar uno o más primeros amplicones, incluyendo los reactivos de amplificación de primer estadio cebadores iniciales para cada polinucleótido diana, en donde el o los primeros amplicones se amplifican en presencia de un indicador fluorescente capaz de generar una señal óptica relacionada con una cantidad de un amplicón en la reacción de amplificación de primer estadio;

b) controlar la señal óptica del indicador fluorescente en la reacción de amplificación de primer estadio en la cámara de reacción;

c) retener automáticamente una parte efectiva de la mezcla de reacción de la reacción de amplificación de primer estadio cuando la señal óptica alcanza o supera un nivel umbral;

d) amplificar en la cámara de reacción el o los primeros amplicones en la parte efectiva usando reactivos de amplificación de segundo estadio en una segunda mezcla de reacción para formar uno o más segundos amplicones, incluyendo los reactivos de amplificación de segundo estadio al menos un cebador secundario para cada uno del o los primeros amplicones, de modo que cada cebador secundario esté anidado en dicho primer amplicón en relación con un cebador inicial de dicho primer amplicón; y

e) detectar el o los segundos amplicones para determinar la presencia o ausencia del o los polinucleótidos diana en la muestra.

Reacciones de amplificación de ácido nucleico de múltiples estadios en sistema cerrado Campo de la invención

La invención se refiere en general a métodos para analizar una muestra con respecto a la presencia de uno o más ácidos nucleicos y, más particularmente, a métodos para realizar reacciones de amplificación de ácido nucleico de múltiples estadios, especialmente reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), en condiciones cerradas.

Antecedentes

Las reacciones de amplificación de ácido nucleico son cruciales para muchas aplicaciones de investigación, médicas e industriales. Dichas reacciones se usan en investigación clínica y biológica, detección y control de enfermedades infecciosas, detección de mutaciones, detección de marcadores de cáncer, control ambiental, identificación genética, detección de patógenos en aplicaciones de biodefensa, y similares, por ejemplo Schweitzer et al, Current Opinión in Biotechnology, 12: 21-27 (21); Koch, Nature Reviews Drug Discovery, 3: 749-761 (24). En particular, las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) ha encontrado aplicaciones en todas estas áreas, incluyendo aplicaciones para detección viral y bacteriana, control de carga viral, detección de patógenos poco habituales y/o difíciles de cultivar, detección rápida de amenazas de bioterrorismo, detección de enfermedad residual mínima en pacientes de cáncer, ensayos de patógenos alimentarios, exploración de suministro de sangre y similares, por ejemplo Mackay, Clin. Microbiol. Infecí., 1: 19-212 (24); Bernard et al, Clinical Chemistry, 48: 1178-1185 (22). Con respecto a la PCR, las razones clave para dicho uso generalizado son su velocidad y facilidad de uso (típicamente se realiza en unas pocas horas usando kits normalizados e instrumentos relativamente simples y de bajo coste), su sensibilidad (con frecuencia pueden detectarse varias decenas de copias de una secuencia diana en una muestra) y su robustez (se analizan fácilmente muestras de baja calidad o muestras conservadas, tales como muestras forenses o muestras de tejido fijo), Strachan y Read, Human Molecular Genetics 2 (John Wiley & Sons, Nueva York, 1999).

A pesar de los avances en las técnicas de amplificación de ácido nucleico que se reflejan en dichas aplicaciones generalizadas, aún existe la necesidad de mejoras adicionales en la velocidad y sensibilidad, particularmente en áreas tales como la detección de enfermedades infecciosas, detección de enfermedad residual mínima, aplicaciones de biodefensa y similares.

Se han obtenido mejoras significativas en la sensibilidad de las PCR usando conjuntos anidados de cebadores en una reacción de amplificación de dos estadios, por ejemplo Albert et al, J. Clin. Microbiol., 28: 156-1564 (199). En este enfoque, el amplicón de una primera reacción de amplificación se convierte en la muestra para una segunda reacción de amplificación usando un nuevo conjunto de cebadores, al menos uno de los cuales se une con una localización interior del primer amplicón. Aunque aumenta la sensibilidad, el enfoque padece un aumento de la manipulación del reactivo y aumento del riesgo de introducir secuencias contaminantes, lo que puede conducir a falsos positivos. Se han realizado intentos de superar estos obstáculos con las llamadas PCR anidadas de tubo cerrado; sin embargo, dichos enfoques se basan principalmente en esquemas para secuestrar reactivos en diferentes secciones del mismo recipiente de reacción de modo que pueda iniciarse una reacción del segundo estadio forzando a los reactivos a permanecer juntos por algún proceso físico, tal como centrifugación, por ejemplo Yourno, PCR Methods and Applications, 2: 6-65 (1992); Wolff et al, PCR Methods and Applications, 4: 376-379 (1995); Olmos et al, Nucleic Acids Research, 27: 1564-1565 (1999). Por lo tanto, están presentes partes sustanciales de componentes de la reacción de primer estadio en la reacción de segundo estadio.

También se han obtenido mejoras significativas en la sensibilidad y una reducción de los falsos positivos llevando a cabo reacciones en ambientes cerrados. Un inconveniente de las técnicas de amplificación altamente sensibles es la aparición de resultados de ensayo de falso positivo, provocada por la amplificación inapropiada de secuencias no diana, por ejemplo Borst et al, Eur. J. Clin. Microbiol. Infecí. Dis., 23: 289-299 (24). La presencia de secuencias no diana puede deberse a la falta de especificidad de la reacción, o a contaminación de reacciones anteriores (es decir contaminación de "arrastre") o a contaminación del ambiente inmediato, por ejemplo agua, productos desechables, reactivos, etc. Dichos problemas pueden aliviarse llevando a cabo amplificaciones en recipientes cerrados, de modo que una vez que se ha añadido una muestra y reactivos y el recipiente se ha sellado, no tiene lugar más manipulación de los reactivos o productos. Dichas operaciones se han hecho posibles en gran medida por la aparición de amplificaciones "en tiempo real" que emplean marcadores que indican continuamente la cantidad de un producto en una mezcla de reacción.

El documento US5229279 desvela una cubeta y método de uso para evitar que el ácido nucleico amplificado por PCR se libere a la atmósfera cuando aún se está detectando. El documento WO1/84463 describe un método, aparato y programa informático para el análisis cuantitativo de una reacción de amplificación de ácido nucleico, el documento US5556773 describe un método o aparato para PCR anidada con tubos de reacción cerrados individuales. Una divulgación anónima (3964) de la Base de Datos de Divulgación de Investigación (abril de 1997) desvela un procesador de PCT que consiste en bloques calentadores preacondicionados que se colocan

secuencialmente en contacto con un blíster de fluidos.

A pesar de los intentos de amplificaciones de múltiples estadios en recipientes cerrados, la técnica actual carece de métodos o sistemas en los que puedan tener lugar reacciones de múltiples estadios sin la posibilidad de que haya efectos de interferencia de componentes indeseados, por ejemplo cebadores u otros componentes, de reacciones previas. En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de nuevos enfoques para llevar a cabo reacciones de amplificación de múltiples estadios cerradas que tengan la conveniencia de técnicas de un único estadio, pero que tengan la mayor sensibilidad proporcionada por una amplificación de múltiples estadios usando cebadores anidados.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para reacciones de amplificación de ácido nucleico de múltiples estadios cerradas en donde una parte de una mezcla de reacción del estadio previo actúa como la muestra para la reacción del siguiente estadio.

En particular la invención proporciona un método para realizar una reacción de amplificación anidada, comprendiendo el método las etapas de:

a) realizar una reacción de amplificación de primer estadio en una cámara de reacción de un sistema cerrado de forma fluida, comprendiendo la reacción de amplificación del primer estadio uno o más polinucleótidos diana de una muestra usando reactivos de amplificación de primer estadio en una primera mezcla de reacción para formar uno o más primeros amplicones, incluyendo los reactivos de amplificación del primer estadio cebadores iniciales para cada polinucleótido diana, en donde el o los primeros amplicones se amplifican en presencia de un indicador fluorescente capaz de generar una señal óptica relacionada con una cantidad de un amplicón en la reacción de amplificación del primer estadio;

b) controlar la señal óptica del indicador fluorescente en la reacción de amplificación de primer estadio en la cámara de reacción;

c) retener automáticamente una parte efectiva de la mezcla de reacción de la reacción de amplificación del primer estadio cuando la señal óptica alcanza o supera un nivel umbral;

d) amplificar en la cámara de reacción el o los primeros amplicones en la parte efectiva usando reactivos de amplificación de segundo estadio en una segunda mezcla de reacción para formar uno o más segundos amplicones, incluyendo los reactivos de amplificación de segundo estadio al menos un cebador secundario para cada uno del o los primeros amplicones, de modo que cada cebador secundario esté anidado en dicho primer amplicón en relación con un cebador inicial de dicho primer amplicón; y

e) detectar el o los segundos amplicones para determinar la presencia o ausencia del o los polinucleótidos diana

en la muestra.

El método se usa para detectar la presencia o ausencia de uno o más polinucleótidos diana en una muestra que tiene las siguientes etapas: (a) amplificar en un sistema... [Seguir leyendo]

1. Un método para realizar una reacción de amplificación anidada, comprendiendo el método las etapas de:

a) realizar una reacción de amplificación de primer estadio en una cámara de reacción de un sistema cerrado de forma fluida, comprendiendo la reacción de amplificación de primer estadio uno o más polinucleótidos diana de una muestra usando reactivos de amplificación de primer estadio en una primera mezcla de reacción para formar uno o más primeros amplicones, incluyendo los reactivos de amplificación de primer estadio cebadores iniciales para cada polinucleótido diana, en donde el o los primeros amplicones se amplifican en presencia de un indicador fluorescente capaz de generar una señal óptica relacionada con una cantidad de un amplicón en la reacción de amplificación de primer estadio;

b) controlar la señal óptica del indicador fluorescente en la reacción de amplificación de primer estadio en la cámara de reacción;

c) retener automáticamente una parte efectiva de la mezcla de reacción de la reacción de amplificación de primer estadio cuando la señal óptica alcanza o supera un nivel umbral;

d) amplificar en la cámara de reacción el o los primeros amplicones en la parte efectiva usando reactivos de amplificación de segundo estadio en una segunda mezcla de reacción para formar uno o más segundos amplicones, incluyendo los reactivos de amplificación de segundo estadio al menos un cebador secundario para cada uno del o los primeros amplicones, de modo que cada cebador secundario esté anidado en dicho primer amplicón en relación con un cebador inicial de dicho primer amplicón; y

e) detectar el o los segundos amplicones para determinar la presencia o ausencia del o los polinucleótidos diana en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la cámara de reacción comprende un volumen muerto, que retiene la parte efectiva de la mezcla de reacción de la reacción de amplificación de primer estadio en la etapa c).

3. El método de la reivindicación 1, en donde la cámara de reacción comprende un miembro de retención situado en la cámara de reacción para retener un volumen definido del líquido en la cámara de reacción siempre que el resto del líquido se retire de la cámara de reacción, y en donde la etapa c) comprende retener la parte efectiva de la mezcla de reacción de la reacción de amplificación de primer estadio por el miembro de retención.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicha mezcla de reacción de dicha reacción de amplificación de primer estadio es en una primera cámara de reacción del sistema de reacción cerrado de forma fluida y en donde la etapa c) comprende además transferir de forma fluida dicha parte efectiva de dicha mezcla de reacción de primer estadio a una segunda cámara de reacción.

5. El método de la reivindicación 1, en donde dicha mezcla de reacción de dicha reacción de amplificación de primer estadio está en la cámara de reacción del sistema de reacción cerrado de forma fluida y en donde la etapa c) comprende además transferir de forma fluida dicha mezcla de reacción de primer estadio a un depósito de residuos, excepto por una parte efectiva que se queda en la primera cámara de reacción.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicha primera cámara de reacción tiene un fondo y un orificio de salida situado por encima del fondo de modo que siempre que dicha mezcla de reacción de primer estadio se transfiera de forma fluida a dicho depósito de residuos a través del orificio de salida se retiene un volumen de dicha mezcla de reacción de primer estadio en dicha primera cámara de reacción por debajo del orificio de salida.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicho volumen retenido en dicha primera cámara de reacción incluye dicha parte efectiva.

8. El método de la reivindicación 1, en donde dicha parte efectiva es un volumen de dicha mezcla de reacción suficiente para contener al menos 1 moléculas de dichos uno o más primeros amplicones.

9. El método de la reivindicación 1, en donde dicha mezcla de reacción tiene un volumen y en donde dicha parte efectiva es un porcentaje del volumen de dicha mezcla de reacción, seleccionándose el porcentaje del intervalo de ,5 a 1 por ciento.

1. El método de la reivindicación 1, en donde dicho nivel umbral es un múltiplo de un nivel de señal de línea basal, seleccionándose el múltiplo del intervalo de 1,5 a 25.

11. El método de la reivindicación 1, en donde dicho nivel umbral se corresponde con un máximo, mínimo o valor cero de una curva de crecimiento definida por la señal óptica.

12. El método de la reivindicación 1, en donde dicho indicador fluorescente se selecciona de un colorante de intercalación que se une específicamente con ADN bicatenario o comprende un resto oligonucleotídico que se une específicamente con un producto de amplificación.

13. El método de la reivindicación 1, en donde dichos uno o más primeros amplicones se producen por amplificación de una secuencia de referencia en dicha reacción de amplificación de primer estadio.

14. El método de la reivindicación 1, en donde dichos uno o más primeros amplicones se producen por amplificación de un polinucleótido diana en dicha reacción de amplificación de primer estadio.

15. El método de la reivindicación 1, en donde dicho sistema de reacción cerrado de forma fluida comprende:

dicha cámara de reacción de forma seleccionable en comunicación fluida con un depósito de muestras que contiene dicha muestra, un primer depósito de reactivos que contiene reactivos de amplificación de primer estadio, y un segundo depósito de reactivos que contiene reactivos de amplificación de segundo estadio, estando cada uno de dichos depósitos cerrado de forma fluida; y

una bomba asociada operativamente con una válvula rotatoria para transferir de forma fluida dicha muestra y dichos reactivos de amplificación de primer estadio a la cámara de reacción, para retener automáticamente dicha parte efectiva de dicha primera mezcla de reacción siempre que dicha señal óptica sea igual o mayor que dicho nivel predeterminado; y para transferir de forma fluida dichos reactivos de amplificación de segundo estadio a la cámara de reacción para amplificar dichos uno o más primeros amplicones en dicha parte efectiva.

16. El método de la reivindicación 15, en donde dicha válvula rotatoria comprende un pistón, retirando el impulso hacia abajo del pistón dicha primera mezcla de reacción de la cámara de reacción, y en donde se consigue retener automáticamente dicha parte efectiva de dicha primera mezcla de reacción llevando a cabo el impulso hacia abajo del pistón bajo control predeterminado.

17. El método de la reivindicación 1, en donde cada una de dichas reacciones de amplificación es una reacción en cadena de la polimerasa o una reacción de NASBA.