Aparato y método para el fraccionamiento rápido de células o virus.

Un aparato para fraccionar células o virus, comprendiendo dicho aparato:

a) Un envase (18) con una cámara (40) para albergar las células o virus, donde el envase (18) incluye al menosuna pared (46; 86) que define la cámara (40) y donde la pared (46; 86) tiene una superficie exterior a la cámara(40);

b) un dispositivo transductor (38) para vibrar a una frecuencia y amplitud operativa suficiente como para generarondas de presión o pulsos de presión en la cámara (40) cuando el dispositivo transductor (38) se acopla a lapared (46; 86); y

c) medios para acoplar el dispositivo transductor a la superficie exterior de la pared con una fuerza de precargasuficiente para provocar un esfuerzo dentro de la pared;

donde la frecuencia natural de la pared (46; 86), cuando la pared se somete a un esfuerzo ejercido por la fuerza deprecarga, es igual a la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) o menor que la frecuencia operativa deldispositivo transductor (38) en menos del 50 % de la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38).

Aparato y método para el fraccionamiento rápido de células o virus

Campo de la invención La presente invención se refiere a un aparato y método para el fraccionamiento rápido de células o virus.

Antecedentes de la invención La extracción de ácido nucleico de células o virus es una tarea necesaria para múltiples aplicaciones en los campos de la biología molecular y el diagnóstico biomédico. Una vez liberado de las células, el ácido nucleico puede utilizarse para el análisis genético, por ejemplo, para la secuenciación, identificación y cuantificación de patógenos, análisis de las mutaciones del ácido nucleico, análisis del genoma, estudios de la expresión génica, monitorización 15 farmacológica, almacenamiento de bibliotecas de ADN para el descubrimiento de fármacos, etc. El análisis genético generalmente implica la amplificación y detección de ácido nucleico utilizando técnicas conocidas. Por ejemplo, las reacciones conocidas de amplificación de polinucleótidos incluyen la reacción en cadena de polimerasa (PCR; polymerase chain reaction, por sus siglas en inglés) , reacción en cadena de ligasa (LCR; ligase chain reaction, por sus siglas en inglés) , amplificación de replicasa QB (QBR; QB replicase amplification, por sus siglas en inglés) , replicación de secuencia autosostenida (3SR; self-sustained sequence replication, por sus siglas en inglés) , amplificación del desplazamiento de la cadena (SDA; strand-displacement amplification, por sus siglas en inglés) , amplificación del ADN de “cadena ramificada”, transcripción activada por ligamiento (LAT; ligation activated transcription, por sus siglas en inglés) , amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA; nucleic acid sequence-based amplification, por sus siglas en inglés) , amplificación del círculo rodante (RCA; rolling circle amplification; por sus siglas en inglés) , reacción de reparación de cadena (RCR; repair chain reaction, por sus siglas en inglés) y reacción de sonda cíclica (CPR; cycling probe reaction, por sus siglas en inglés) .

La extracción de ácidos nucleicos de células o virus generalmente se lleva a cabo mediante métodos físicos o químicos. Los métodos químicos suelen emplear agentes lisantes (por ejemplo, detergentes, encimas u orgánicos fuertes) para fraccionar las células y liberar el ácido nucleico, seguido del tratamiento del extracto con sales caotrópicas para desnaturalizar cualquier proteína contaminante o con potencial para interferir. Dichos métodos químicos se describen en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.652.141 de Henco et al. y Patente de los Estados Unidos Nº 5.856.174 de Lipshutz et al. Una desventaja del uso de químicos potentes para fraccionar células es que los químicos son inhibidores de la posterior amplificación del ácido nucleico. En el uso de métodos de fraccionamiento químico, por tanto, generalmente es necesario purificar el ácido nucleico liberado de las células antes de proceder con otros análisis. Dichas etapas de purificación conllevan tiempo, son caras y reducen la cantidad de ácido nucleico recuperado para el análisis.

Los métodos físicos para fraccionar células no suelen requerir químicos potentes que inhiben la amplificación del ácido nucleico (por ejemplo la PCR) . Estos métodos físicos, no obstante, también presentan desventajas. Por ejemplo, un método físico para fraccionar células conlleva colocar las células en una solución y calentar la solución hasta que hierva para romper la pared de las células. Desgraciadamente, el calor suele desnaturalizar las proteínas y provocar que las proteínas se peguen al ácido nucleico liberado. Las proteínas interfieren por tanto con los posteriores intentos para amplificar el ácido nucleico. Otro método físico es el hielo-deshielo en el que las células se 45 hielan y deshielan repetidamente hasta que la pared de las células se rompe. Desgraciadamente, el hielo-deshielo suele ser incapaz de romper muchas estructuras, especialmente ciertas esporas y virus que tienen capas exteriores extremadamente fuertes.

Otro método físico para fraccionar células es el uso de un instrumento de presión. Con este método, una solución de microorganismos micobacterianos se hace pasar a alta presión a través de un orificio de diámetro muy pequeño. Durante el paso a través del orificio, las micobacterias se rompen debido a las fuerzas mecánicas y su contenido interno se vierte en la solución. Dicho sistema, no obstante, tiene cierta envergadura, es caro y requiere un sistema de enfriado para evitar un desarrollo excesivo del calor que dañaría el contenido de las células lisadas. Además, el instrumento debe limpiarse y descontaminarse entre cada utilización y se requiere un sistema de envase de gran 55 tamaño cuando se manipula material infeccioso. Otra desventaja de este sistema es que la solución solo debe contener partículas que sean sustancialmente del mismo tamaño, de forma que no se pueda utilizar para procesar muchos de los especímenes clínicos o biológicos no tratados.

También se conoce que las células se pueden lisar sometiendo a las células a agitación por ultrasonidos. Este método es divulgado por Murphy et al. en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.374.522. De acuerdo con el método, las soluciones o suspensiones de células se colocan en un envase con perlas pequeñas.

El envase se coloca entonces en un baño de ultrasonidos hasta que se fraccionan las células, liberando sus componentes celulares. Este método tiene varias desventajas. En primer lugar, la distribución de la energía por 65 ultrasonidos en el baño no es uniforme, por lo que un técnico deberá ubicar una zona de energía elevada dentro del baño y colocar el envase en esa zona. La distribución no uniforme de la energía por ultrasonidos produce además resultados inconsistentes. En segundo lugar, el baño de ultrasonidos no focaliza la energía en el envase, por lo que el fraccionamiento de las células suele tardar varios minutos en completarse, un periodo de tiempo relativamente largo comparado con el método de la presente invención. En tercer lugar, no resulta práctico llevar un baño de ultrasonidos al campo para utilizarlo en la detección de guerras biológicas, análisis forenses o pruebas in situ de muestras medioambientales.

Otro método para el lisado de células por ultrasonidos se divulga en la Patente de Estados Unidos Nº 4.983.523 de Li. De acuerdo con el método, los ácidos nucleicos se liberan de las células, bacterias y virus sometiendo a ultrasonidos, de forma no invasiva, a una muestra contenida dentro de un envase de muestras que se pone en contacto físico con el elemento vibrador de un sistema de ultrasonidos calibrado para resonar a una frecuencia de 40kHz o superior. Un problema principal al poner en contacto la pared de un envase de muestras con el elemento vibrador de un sistema de ultrasonidos es que es muy probable que la vibración del sistema de ultrasonidos contra la pared provoque daños graves en la pared (generalmente derritiéndola o agrietándola) , lo que lleva a la contaminación de la zona de trabajo, un peligro para la salud del operador y la pérdida de la muestra que se iba a analizar.

Sumario La presente invención proporciona un aparato y método mejorado para fraccionar células o virus para liberar el ácido nucleico de los mismos.

En una realización preferida, el aparato comprende un envase que tiene una cámara para albergar un líquido o gel que contiene las células o virus que se van a fraccionar. El envase incluye al menos una pared que define la cámara y la pared tiene una superficie exterior a la cámara. El aparato comprende además un dispositivo transductor para vibrar a una frecuencia y amplitud operativa suficiente como para generar ondas de presión o pulsos de presión en la cámara cuando el dispositivo transductor se ha acoplado a la pared. El aparato comprende además medios para acoplar el dispositivo transductor a la superficie exterior de la pared con una fuerza de precarga suficiente como para crear un esfuerzo en la pared. La frecuencia natural de la pared, cuando la pared se somete al esfuerzo ejercido por la fuerza de precarga, es igual a la frecuencia operativa del dispositivo transductor o menor que la frecuencia operativa del dispositivo transductor en menos del 50% de la frecuencia operativa del dispositivo transductor.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para fraccionar células o virus. El método comprende la etapa de albergar un líquido o gel que contiene las células o virus en la cámara de un envase. El envase incluye al menos una pared que define la cámara y la pared tiene una superficie exterior a la cámara. Un dispositivo... [Seguir leyendo]

1. Un aparato para fraccionar células o virus, comprendiendo dicho aparato:

a) Un envase (18) con una cámara (40) para albergar las células o virus, donde el envase (18) incluye al menos una pared (46; 86) que define la cámara (40) y donde la pared (46; 86) tiene una superficie exterior a la cámara (40) ; b) un dispositivo transductor (38) para vibrar a una frecuencia y amplitud operativa suficiente como para generar ondas de presión o pulsos de presión en la cámara (40) cuando el dispositivo transductor (38) se acopla a la pared (46; 86) ; y c) medios para acoplar el dispositivo transductor a la superficie exterior de la pared con una fuerza de precarga suficiente para provocar un esfuerzo dentro de la pared;

donde la frecuencia natural de la pared (46; 86) , cuando la pared se somete a un esfuerzo ejercido por la fuerza de 15 precarga, es igual a la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) o menor que la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) en menos del 50 % de la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) .

2. El aparato de la reivindicación 1, donde la frecuencia operativa es de ultrasonidos.

3. El aparato de la reivindicación 2, donde el dispositivo transductor (38) comprende un cuerno de ultrasonidos que tiene una punta (50) acoplada a la pared (46; 86) y donde la frecuencia operativa es la frecuencia de resonancia del cuerno.

4. El aparato de la reivindicación 1, donde el dispositivo transductor (38) comprende un apilamiento piezoeléctrico. 25

5. El aparato de la reivindicación 1, donde la pared (46, 86) tiene forma de cúpula y es convexa con respecto al dispositivo transductor (38) .

6. El aparato de la reivindicación 1, donde la pared (46; 86) es esférica y convexa con respecto al dispositivo 30 transductor (38) .

7. El aparato de la reivindicación 1, donde la pared (46; 86) es plana.

8. El aparato de la reivindicación 7, donde la pared (46; 86) incluye una parte central (88) y nervaduras de refuerzo 35 (90) que se extienden radialmente desde la parte central (88) .

9. El aparato de la reivindicación 1, comprendiendo este además perlas (66) en la cámara (40) para romper las células o virus.

10. El aparato de la reivindicación 1, donde la cámara (40) tiene al menos dos puertos colocados para permitir el flujo de una muestra a través de la cámara (40) y donde el aparato comprende además un material en fase sólida en la cámara (40) para capturar las células o virus según fluye la muestra a través de la cámara (40) .

11. El aparato de la reivindicación 1, donde la frecuencia natural de la pared (46; 86) , cuando la pared (46; 86) se 45 somete a un esfuerzo ejercido por la fuerza de precarga, es igual a la frecuencia operativa del dispositivo transductor

(38) o menor que la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) en menos del 25 % de la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) .

12. El aparato de la reivindicación 1, donde la frecuencia natural de la pared (46; 86) , cuando la pared (46; 86) se 50 somete a un esfuerzo ejercido por la fuerza de precarga, es igual a la frecuencia operativa del dispositivo transductor

(38) o menor que la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) en menos del 10 % de la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) .

13. El aparato de la reivindicación 1, donde la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) está en el

intervalo de 20 a 120 kHz, la amplitud del movimiento vibratorio del dispositivo transductor (38) está en el intervalo de 5 a 60 micrómetros y la fuerza de precarga está en el intervalo de 2 a 50 N.

14. El aparato de la reivindicación 1, donde los medios para acoplar el dispositivo transductor (38) a la pared (46; 86) comprenden una estructura de apoyo para sujetar el envase (18) y el dispositivo transductor (38) el uno contra el

otro de forma que la superficie vibratoria del dispositivo transductor (38) se ponga en contacto con la superficie exterior de la pared (46; 86) , incluyendo dicha estructura de apoyo un cuerpo elástico para proporcionar la fuerza de precarga.

15. El aparato de la reivindicación 14, donde el cuerpo elástico comprende un resorte. 65

16. El aparato de la reivindicación 1, donde los medios para acoplar la superficie vibratoria del dispositivo transductor

(38) a la pared (46; 86) comprenden una abrazadera.

17. Un método para fraccionar células o virus, comprendiendo el método las etapas de:

a) albergar un líquido o gel que contiene las células o virus en la cámara (40) de un envase (18) donde el envase (18) incluye al menos una pared (46; 86) que define la cámara (40) y donde la pared (46; 86) tiene una superficie exterior a la cámara (40) ; b) acoplar un dispositivo transductor (38) a la superficie exterior de la pared (46; 86) con una fuerza de precarga suficiente como provocar un esfuerzo dentro de la pared (46; 86) ; y c) operar el dispositivo transductor (38) a una frecuencia y amplitud suficientes como para generar ondas de presión o pulsos de presión en la cámara (40) ;

donde la frecuencia natural de la pared (46; 86) , cuando la pared (46; 86) se somete a un esfuerzo ejercido por la fuerza de precarga, es igual a la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) o menor que la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) en menos del 50 % de la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) .

18. El método de la reivindicación 17, donde la frecuencia operativa es de ultrasonidos. 20

19. El método de la reivindicación 17, donde el dispositivo transductor (38) comprende un cuerno de ultrasonidos que tiene una punta (50) acoplada a la pared (46; 86) , y donde la frecuencia operativa es la frecuencia de resonancia del cuerno.

20. El método de la reivindicación 17, donde el dispositivo transductor (38) comprende un apilamiento piezoeléctrico.

21. El método de la reivindicación 17, donde la pared (46; 86) tiene forma de cúpula y es convexa con respecto al dispositivo transductor (38) .

22. El método de la reivindicación 17, donde la pared (46; 86) es esférica y convexa con respecto al dispositivo transductor (38) .

23. El método de la reivindicación 17, donde la pared (46; 86) es plana.

24. El método de la reivindicación 23, donde la pared (46; 86) incluye una parte central (88) y nervaduras de refuerzo (90) que se extienden radialmente desde la parte central (88) .

25. EL método de la reivindicación 17, comprendiendo este además la etapa de agitar las perlas (66) en la cámara (40) para romper las células o virus. 40

26. El método de la reivindicación 17, comprendiendo además la etapa de capturar las células o virus en un material en fase sólida en la cámara (40) forzando a una muestra fluida que contiene las células o virus a que fluya a través de la cámara (40) .

27. El método de la reivindicación 17, donde la frecuencia natural de la pared (46; 86) , cuando la pared (46; 86) se somete a un esfuerzo ejercido por la fuerza de precarga, es igual a la frecuencia operativa del dispositivo transductor

(38) o menor que la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) en menos del 25 % de la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) .

28. El método de la reivindicación 17, donde la frecuencia natural de la pared (46; 86) , cuando la pared (46; 86) se somete a un esfuerzo ejercido por la fuerza de precarga, es igual a la frecuencia operativa del dispositivo transductor

(38) o menor que la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) en menos del 10 % de la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) .

29. El método de la reivindicación 17, donde la frecuencia operativa del dispositivo transductor (38) está en el intervalo de 20 a 120 kHz, la amplitud del movimiento vibratorio del dispositivo transductor (38) está en el intervalo de 5 a 60 micrómetros y la fuerza de precarga está en el intervalo de 2 a 50 N.