Procedimiento novedoso para preparar G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos).

Procedimiento para asilar y purificar factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) a partir de unmicroorganismo que produce G-CSF que consiste en las siguientes etapas;

a) lisar el microorganismo ajustando la densidad y la temperatura de una suspensión de pasta celular yseparar material insoluble que comprende G-CSF,

b) aislar el cuerpo de inclusión (IB) que comprende G-CSF en presencia de agente tensioactivo iónico

c) solubilizar el G-CSF presente en el material insoluble, usando un agente caotrópico altamenteconcentrado y un agente desnaturalizante que es tris(2-carboxietil)fosfina HCl (TCEP)

d) oxidar el G-CSF en presencia de cistina/cisteína siendo la razón molar de 1:10,

e) replegar el G-CSF en condiciones de temperatura controlada mediante un método de una etapa,

f) concentrar la disolución de G-CSF replegado usando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) queusa cartuchos o casetes con un punto de corte de peso molecular de 5-12 KDa,

g) desalar la disolución de G-CSF concentrada en una columna de temperatura controlada y separar ladisolución de G-CSF del caótropo mediante filtración en gel,

h) someter la disolución de G-CSF a cromatografía de intercambio catiónico,

i) recuperar el G-CSF purificado en tampón de formulación en forma estable,

j) eliminar endotoxinas usando cromatografía de intercambio aniónico de tipo básico fuerte.

Procedimiento novedoso para preparar G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos)

Aspecto técnico La presente invención se refiere a un procedimiento novedoso de aislamiento y purificación de factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) a partir de un microorganismo que produce G-CSF, más específicamente G-CSF es metionil-G-CSF humano recombinante (rmetHuG-CSF) .

Antecedentes de la invención El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es una proteína de 175 aminoácidos preparada mediante tecnología de ADN recombinante. El G-CSF se produce mediante bacterias Escherichia coli (E. coli) en el que se ha insertado el gen del factor estimulante de colonias de granulocitos humano. La proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia natural predicha a partir del análisis de secuencia de ADN humano, excepto por la adición de una metionina en el extremo N-terminal, necesaria para la expresión en E. coli. Debido a que G-CSF se produce en E. coli, el producto no está glicosilado y por tanto se difiere del G-CSF aislado a partir de una célula humana.

El G-CSF se suministra o bien en viales o bien en jeringas precargadas. El producto está disponible en jeringas precargadas y viales de un solo uso. Los viales de un solo uso contienen o bien 300 mcg o bien 480 mcg de G-CSF en un volumen de llenado de 1, 0 ml o 1, 6 ml respectivamente. Las jeringas precargadas de un solo uso contienen o bien 300 mcg o bien 480 mcg de G-CSF en un volumen de llenado de 0, 5 ml o 0, 8 ml respectivamente.

La secuencia de aminoácidos de G-CSF humano se muestra en la figura 1. El primer aminoácido de la proteína madura se determinó mediante secuenciación directa de aminoácidos de las proteínas purificadas. Los ARNm de G-CSF humano codifican para una secuencia líder hidrófoba de 30 aminoácidos típica de proteínas secretadas. El G-CSF tiene dos enlaces disulfuro formados por residuos de cisteína homólogos (figura 1) y un residuo de cisteína adicional en la posición 17 que no puede participar en enlaces disulfuro intramoleculares. Los enlaces disulfuro en estas moléculas estabilizan las estructuras y las hacen resistentes a tratamiento relativamente riguroso (algunas proteasas, temperaturas altas, disolventes desnaturalizantes, pH extremo) , que conducen a la desnaturalización tras la reducción de enlaces disulfuro (Nicos A. Nicola, The walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, “Granulocyte Colony Stimulating Factor”, pág. 77-100) .

El G-CSF humano puede producirse en organismos eucariotas (levadura y líneas celulares de mamífero) y organismos procariotas como bacterias. La forma en la se produce G-CSF depende del tipo de organismo huésped usado para la expresión. Si el G-CSF se expresa en células eucariotas, se produce en una forma soluble y se secreta. Cuando el G-CSF se produce en células procariotas, el producto se forma como cuerpos de inclusión (IB) inactivos. Normalmente los cuerpos de inclusión tienen una estructura secundaria y están agregados densamente. Se revela que la combinación de tantos factores del estado fisiológico de célula huésped y condiciones de crecimiento se ve afectada por la formación de cuerpos de inclusión.

El G-CSF producido en células procariotas, tales como las de E. coli, está en cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión son agregados nucleares o citoplasmáticos de sustancias que pueden teñirse, habitualmente proteínas. La purificación de las proteínas expresadas a partir de cuerpos de inclusión requiere habitualmente dos etapas principales; extracción de cuerpos de inclusión a partir de las bacterias seguido por la solubilización de los cuerpos de inclusión purificados.

La producción de proteína de G-CSF humano biológicamente activa a partir de cuerpos de inclusión inactivos expresada mediante tecnología de ADNr en células huésped procariotas usadas comúnmente es muy difícil. Se desean metodologías de procedimiento eficaces para la fabricación de G-CSF terapéuticamente útil a escala industrial. Se han notificado diversos métodos en la bibliografía científica para la producción de G-CSF en E. coli, levadura o células CHO (ovario de hámster chino) de mamífero.

Muchas patentes describen diversos aspectos de expresión y purificación de proteína G-CSF a partir de diferentes sistemas de expresión como células procariotas y eucariotas. La expresión de G-CSF en sistemas bacterianos se describe en las patentes estadounidenses, US 4 810 643 (03.03.1986, Kirin-Amgen Inc.) y US 4 999 291 (23.08.1985, Amgen Inc.) . En los procedimientos preferidos, el gen de G-CSF se sintetiza, se clona y se transforma en E. coli. La proteína se expresa induciendo el cultivo elevando la temperatura hasta 42ºC. Las condiciones y los parámetros para la clonación y expresión mediante fermentación no están claros. Varias etapas están implicadas en la construcción del clon. El procedimiento se realiza en condiciones de matraz y el nivel de expresión de proteínas es de tan sólo el 3-5% en base de proteína celular total.

El producto farmacéutico denominado NUPOGEN®, una marca comercial de Amgen Inc., incluye una proteína de 175 aminoácidos preparada mediante tecnología de ADN recombinante. La información de producto que puede recuperarse de la página web en: http://dailymed.nlm.nih.gov/dailymed/archives/fdaDruglnfo.cfm?archiveid=10056 da a conocer que el NEUPOGEN® se produce mediante bacterias Escherichia coli (E. coli) en las que se ha insertado

el gen del factor estimulante de colonias de granulocitos humano. La formulación del producto contiene filgrastim, acetato, sorbitol, polisorbato 80, sodio y agua en una forma adecuada para la administración intravenosa y subcutánea.

El documento WO 2008/096370-A2 da a conocer a procedimiento para aislar y purificar proteína G-CSF a partir de una E. coli que produce G-CSF que comprende lisar el microorganismo y separar G-CSF, aislar cuerpos de inclusión que comprenden G-CSF, solubilizar G-CSF con un agente caotrópico concentrado y un agente reductor tal como DTT, oxidar G-CSF, replegar-concentrar y desalar el mismo, someterlo a cromatografía de intercambio iónico y recuperar G-CSF purificado en una forma estable.

GETZ E B ET AL: “A comparison between the sulfhydr y l reductants tris (2-carboxyethyl) phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistr y ” Analytical Biochemistr y , 15 de agosto de 1999 LNKD-PUBMED: 10452801, vol. 273, n.º 1, páginas 73-80, presentan una comparación entre ditiotreitol (DTT) y tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) en cuanto a: (1) estabilidad a pH neutro, (2) capacidad para conservar la actividad enzimática, (3) interferencia con la unión de marcadores a los tioles de proteína, (4) reducción de sondas de espín de nitróxido, y (5) capacidad para provocar degradación de proteínas no deseadas a temperaturas elevadas usadas en preparaciones de electroforesis en gel. Sin embargo, no se propone TCEP para aumentar el rendimiento del procedimiento rompiendo eficazmente los enlaces disulfuro con una actividad de desplegado en un procedimiento, por ejemplo para la producción del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) .

Los documentos EP 0 220 520 (30.09.1985, Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha) , WO 87/01132 (23.08.1985, Kirin-Amgen Inc.) y WO 88/01297 (11.08.1986, Cetus Corporation) describen la clonación de G-CSF.

La patente estadounidense US 5 055 555 (05.01.1989, Sassenfeld, Helmut) describe un procedimiento simplificado para la producción de G-CSF humano a partir de células eucariotas. Lograr la secreción de proteínas a través de organismos eucariotas extracelulares forma una tecnología completamente diferente en comparación con la expresión de proteínas a través de organismos procariotas intracelulares. Aunque el procedimiento descrito en la patente US 5.055.555 es más simple; no puede aplicarse fácilmente a G-CSF recombinante expresado en E. coli u otras células en las que se produce G-CSF en forma de un cuerpo de inclusión. El método anterior se desarrolló para G-CSF soluble expresado y secretado mediante levadura recombinante en el medio de fermentación. Para G-CSF derivado de E. coli, la solubilización de cuerpos de inclusión y el replegado de G-CSF son etapas adicionales que hay que tener en cuenta. Además, hasta la fecha no se ha notificado obtener una preparación de G-CSF de calidad terapéutica libre de endotoxinas lipopolisacáridas, que son contaminantes probables cuando se usa E. coli como huésped, en un procedimiento, simple, ampliable a escala. A escala comercial, las pérdidas de rendimiento de un procedimiento de múltiple etapas se vuelven altamente significativas. Por tanto un procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para asilar y purificar factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) a partir de un microorganismo que produce G-CSF que consiste en las siguientes etapas; a) lisar el microorganismo ajustando la densidad y la temperatura de una suspensión de pasta celular y 5 separar material insoluble que comprende G-CSF,

b) aislar el cuerpo de inclusión (IB) que comprende G-CSF en presencia de agente tensioactivo iónico c) solubilizar el G-CSF presente en el material insoluble, usando un agente caotrópico altamente concentrado y un agente desnaturalizante que es tris (2-carboxietil) fosfina HCl (TCEP) d) oxidar el G-CSF en presencia de cistina/cisteína siendo la razón molar de 1:10,

e) replegar el G-CSF en condiciones de temperatura controlada mediante un método de una etapa, f) concentrar la disolución de G-CSF replegado usando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) que usa cartuchos o casetes con un punto de corte de peso molecular de 5-12 KDa, g) desalar la disolución de G-CSF concentrada en una columna de temperatura controlada y separar la disolución de G-CSF del caótropo mediante filtración en gel,

h) someter la disolución de G-CSF a cromatografía de intercambio catiónico, i) recuperar el G-CSF purificado en tampón de formulación en forma estable, j) eliminar endotoxinas usando cromatografía de intercambio aniónico de tipo básico fuerte.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el G-CSF es metionil-G-CSF humano recombinante (rmetHuG-CSF) .

3. Procedimiento según la reivindicación 1 y 2, en el que la densidad de la pasta celular no es menor de 8 ml de tampón de resuspensión por gramo de IB y la temperatura es de entre 5 y 20ºC.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 y 2, en el que el agente tensioactivo iónico en la etapa de aislamiento es desoxicolato de sodio.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que el agente caotrópico altamente concentrado en la 25 etapa de solubilización es guanidinio HCl en concentraciones de entre 5, 4 M y 6, 6 M.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la temperatura en la etapa de replegado es de entre 7 y 15ºC.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la columna de filtración en gel es Sephadex G-25 Fine.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el tamaño de partícula de perlas de Sephadex G25 Fine es de entre 20 y 300 !m.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la columna se estabiliza en una temperatura de entre 4 y 20ºC grados en la etapa de desalado.

10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la cromatografía de intercambio catiónico consiste 35 en sulfopropilo.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que el tampón de formulación estable en la etapa de recuperación es una disolución acuosa de tampón acetato 10 mM, sorbitol al 5% y polisorbato 80 al 0, 004% ajustado a pH 4, 0.

12. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la etapa de cromatografía de intercambio aniónico 40 de tipo básico fuerte usada en la eliminación de las endotoxinas consiste en amonio cuaternario.

13. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que en la etapa c) el pH es de desde 7, 5 hasta 9, 0.

14. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que en la etapa e) el pH es de desde 7, 0 hasta 8, 0.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo que produce G-CSF es E. coli.

16. Procedimiento según la reivindicación 2, que comprende además la etapa de formular el rmetHuG-CSF según una composición que consiste en: a.

3. 100 MU (300 -1000 !g) de rmetHuG-CSF b) 0, 50-0, 80 mg de acetato c.

2. 100 mg de sorbitol d) 0, 01-0, 10 mg de polisorbato 80 e) agua para inyección f) hidróxido de sodio o ácido acético para el ajuste de pH en 1 ml de disolución estéril.