Procedimiento no proteolítico de determinación de analitos en estructuras queratinizadas.

Un procedimiento para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de unsujeto,

que comprende:

(a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente;

(b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solución acuosa de un agente reductor para dar comoresultado una solución de prueba; en el que el agente reductor comprende DTT o DTE y en el que el pH al cualla etapa de contacto y la etapa de tratamiento se realizan a un pH de entre aproximadamente 8,8 y

aproximadamente 10,5, y

(c) determinar si el analito está presente en la solución de prueba, en la que el procedimiento no comprendeescindir proteolíticamente la muestra de estructura queratinizada.

Procedimiento no proteolítico de determinación de analitos en estructuras queratinizadas Campo de la técnica La presente divulgación se refiere a materiales y procedimientos para determinar la presencia y la cantidad de uno o más analitos de interés en estructuras no queratinizadas de un sujeto y, más particularmente, a materiales y procedimientos para lo mismo que no requieren procesamiento proteolítico de las estructuras queratinizadas.

Antecedentes La presente divulgación se refiere a un procedimiento analítico mejorado que permite la liberación relativamente rápida y el análisis directo de analitos, incluidos analitos orgánicos, tales como ciertas drogas o metabolitos de las mismas, presentes en el pelo y en otras estructuras queratinizadas, por ejemplo las uñas de los dedos de los pies y las uñas de los dedos de las manos. El procedimiento permite la detección selectiva de dichos analitos sin que afecte a la estructura de los analitos y sin que sea perjudicial para las sondas de analitos, por ejemplo anticuerpos, ARN/ADN y sondas de bioreceptores, que se pueden usar para detectar el analito. Por ejemplo, en algunas realizaciones se puede añadir directamente una sonda de analito a una estructura queratinizada que se sospecha que contiene uno o más analitos y que se ha tratado como se describe en el presente documento. De este modo, se puede evaluar la identidad de uno o más analitos, así como la extensión y la duración del consumo del uno o más analitos por un sujeto.

El análisis del pelo y otras estructuras queratinizadas tiene ciertas ventajas sobre las técnicas de análisis de orina, sangre y fluidos orales para la detección de analitos de interés. Estas incluyen facilidad de manipulación y almacenamiento, una amplia ventana de detección, y correlación de la presencia y la cantidad de fármaco con el tiempo de uso y la dosis ingerida. Se sabe que las técnicas en orina, sangre y fluidos orales son desventajosos en cuanto a que la duración y la intensidad de uso o de exposición no se pueden determinar. Estas técnicas pueden, como mucho, proporcionar información a corto plazo concerniente a los analitos ingeridos. Además, también hay problemas con la interpretación de estos resultados. Por ejemplo, la detección de un nivel bajo de la droga ingerida o del metabolito de la droga ingerida en orina podría significar que un sujeto ha ingerido una cantidad pequeña de la droga muy recientemente o una cantidad mayor varios días antes. Por tanto, normalmente, el uso crónico de una droga no se puede determinar con estos procedimientos sin repetir las pruebas.

En respuesta a los problemas de establecer un procedimiento fiable y preciso que mida la duración y la intensidad de los analitos de interés, los trabajos realizados por el Dr. Werner A. Baumgartner, como se indica en Radioimmunoassay of Hair for Determining Opiate Abuse Histories", J. Nucl Med 20:749-752 (1979) , determinaron que los historiales de exposición prolongada a drogas se pueden obtener mediante el análisis de vello corporal de mamífero, ya que estas sustancias quedan “atrapadas” dentro de las fibras de cabello individuales durante la síntesis de las fibras. A este respecto, se demostró que actuaba como una grabadora, es decir, los historiales de exposición pasada se pueden evaluar mediante un análisis seccional de las muestras de pelo. Por ejemplo, se encontró que la morfina, una vez que está en la circulación sanguínea, encuentra su camino hacia el cabello a medida que el pelo se sintetiza.

Se ha determinado que varias sustancias químicas, incluidas las drogas, quedan atrapadas por el pelo durante su síntesis, estas sustancias quedan "encerradas" en el pelo durante esencialmente el tiempo en el que está presente el vello en el cuerpo. Se descubrió que esto era cierto para el cabello de la cabeza y el vello corporal, así como para otras estructuras queratinizadas tales como las uñas de los dedos de la mano; véase Suzuki et al., Forensic Sci. International, 24:9-16, 1984. Estas sustancias atrapadas no se pueden eliminar del pelo y anteriormente se pensaba que solo se liberaban completamente después de la destrucción completa, o caso completa de la fibra de pelo.

Procedimientos previos de extracción de un analito procedente del cabello incluyen someter el cabello a soluciones calientes de methanol, o incubación del cabello durante horas (normalmente durante la noche) en un medio alcalino o acido; Yegles, et al., en: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 73 - 94; Jurado, C. en: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 95-125; Cheze, M. et al. en: Analytical and Practical Aspects of Drug Testing in Hair, CRC Press, 2007, pp. 163 - 185) . Procedimientos anteriores también han incluido el uso de ultrasonidos o de un mortero y martinete junto con un disolvente para ayudar a la extracción.

Los procedimientos de extracción de disolvente pueden sufrir varios problemas para determinar con precisión la presencia y la cantidad de una analito ingerido. Uno de estos problemas es que los procedimientos de extracción de disolvente con frecuencia solo extraen una pequeña fracción desconocida y variable del analito total presente en la muestra de pelo. Otra desventaja es que diferentes analitos pueden requerir diferentes disolventes o diferentes tiempos y temperaturas para la extracción. Además, para el análisis mediante inmunoensayo, se tienen que evaporar los disolventes y muchos de los disolventes son tóxicos y peligrosos.

Otros procedimientos previos usaron una combinación de tratamientos proteolíticos y reductores para digerir completamente y reducir las estructuras queratinizadas con el fin de liberar el uno o más analitos. Véase, por

ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.466.579; 5.324.642; 6.022.693; 6.582.924; y 6.949.344, que proporcionan ejemplos de procedimientos de detección para ensayos de detección selectiva y confirmatorios para analitos de interés, incluyendo procedimientos de inmunoensayo tales como procedimientos radioinmunoensayo y de inmunoensayo enzimático. Dichos procedimientos de tratamiento proteolítico y reductor combinados, aunque eficientes, son relativamente caros debido a los costes de la enzima proteolítica, que también pueden interferir en los posteriores ensayos de detección de analitos mediante escisión proteolítica de las sondas de detección de analitos tales como antibióticos, evitando de este modo el uso de ciertas técnicas analíticas muy sensibles o requiriendo el uso de etapas intermedias de neutralización, separación o purificación de proteasas.

Por tanto, existe la necesidad de un procedimiento de detección de analitos eficiente y relativamente barato que pueda liberar rápida y completamente analitos de estructuras queratinizadas del cuerpo, tal como pelo, uñas de las manos y uñas de los pies, y que pueda permitir la determinación directa de la identidad de los analitos y su duración de uso en un sujeto sin que destruya ni interfiera con los analitos de interés y/o las sondas de detección de analitos, tales como procedimientos de inmunoensayos.

En el documento US 6 949 344 describe procedimientos para el análisis directo de estructuras queratinizadas, por ejemplo pelo. Los procedimientos comprenden el uso de una enzima proteolítica. Nielen et al. (Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences & Applications (2006) 830:126-134) y Ahrens et al. (Fresenius Journal of Analytical Chemistr y (1992) 344:559-560) describen procedimientos para detectar determinadas drogas en el pelo. También, Ciraracos-Cubarsi et al. (Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences & Applications (2006) 834:1425) describen procedimientos para analizar el pelo para monitorización de drogas veterinarias en la producción de ganado. No obstante, los procedimientos descritos en dichos documentos difieren de la materia sujeto de la presente invención, entre otros en las condiciones de pH y el tipo de agente reductor usado.

La invención se puede definir en las reivindicaciones adjuntas.

De acuerdo con una realización de la invención se proporciona un procedimiento para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente; (b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solución acuosa de un agente reductor para dar una solución de prueba en la que el agente reductor comprende DTT o DTE y en la que el pH al cual la etapa de contacto o la etapa de tratamiento se realiza entre 8, 8 y aproximadamente 10, 5 y (c) determinar si el analito está presente en la solución de prueba, en el que el procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, que comprende:

(a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente;

(b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solución acuosa de un agente reductor para dar como resultado una solución de prueba; en el que el agente reductor comprende DTT o DTE y en el que el pH al cual la etapa de contacto y la etapa de tratamiento se realizan a un pH de entre aproximadamente 8, 8 y aproximadamente 10, 5, y

(c) determinar si el analito está presente en la solución de prueba, en la que el procedimiento no comprende escindir proteolíticamente la muestra de estructura queratinizada.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para determinar la presencia de un analito en una muestra de estructura queratinizada de un sujeto, consistiendo el procedimiento esencialmente en:

(a) proporcionar una muestra de estructura queratinizada lavada opcionalmente;

(b) poner en contacto la muestra queratinizada con una solución acuosa de un agente redactor en una solución de prueba;

(c) desactivar el agente reductor residual en la solución de prueba de (b) para dar como resultado una solución de prueba desactivada;

(d) purificar la solución de prueba desactivada de la etapa (c) para eliminar la muestra queratinizada residual y para dar como resultado una solución de prueba desactivada purificada; y

(e) determinar si el analito está presente en la solución de prueba desactivada purificada de la etapa (d) .

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que además comprende determinar la cantidad del analito en la muestra de prueba, si está presente el analito.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende desactivar el agente reductor residual en la solución de prueba.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, que además comprende purificar la solución de prueba eliminar la muestra queratinizada residual.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 4, en la que la etapa de desactivación comprende poner en contacto la solución de prueba con una solución acuosa de una sal metálica, en la que el catión metálico de la sal está seleccionado del grupo que consiste en Cu++, Zn++, Mn++, Fe+++, Fe++, Pb++, Cd++, Hg++, Ag++, As+++, y

Co++ .

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que se determina que el analito está presente o no usando un inmunoensayo específico del analito.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el inmunoensayo específico del analito comprende usar un anticuerpo específico del analito, o en el que el inmunoensayo es un radioinmunoensayo, o en el que el inmunoensayo es un enzimoinmunoensayo, o en el que se determina que el analito está presente o no usando una técnica de espectrometría de masas o una técnica cromatográfica.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el pH al cual se realiza la etapa de contacto o la etapa de tratamiento está entre aproximadamente 8, 8 a aproximadamente 9, 7.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el pH al cual se realiza la etapa de contacto o la etapa de tratamiento es 9, 0, 9, 1, 9, 2, 9, 3, 9, 4, 9, 5, 9, 55, 9, 6, o 9, 65.

11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la temperatura a la cual se realiza la etapa de contacto o la etapa de tratamiento está entre aproximadamente 20 ºC y aproximadamente 40 ºC.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la etapa de contacto o de tratamiento se produce durante un periodo de tiempo de aproximadamente 0, 5 horas a aproximadamente 12 horas, o de aproximadamente 0, 5 a aproximadamente 3 horas o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 horas o durante un periodo de tiempo de aproximadamente 2 horas.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el analito es una droga o metabolito de la misma, un medicamento de prescripción o metabolito del mismo, un analgésico o metabolito del mismo, un nutriente

o un analito endógeno o una sal de cualquiera de los anteriores, en el que opcionalmente la droga o metabolito de la misma está seleccionada del grupo que consiste en: cocaína, benzoilecgonina, cocaetileno, norcocaína, PCP, anfetamina, metanfetamina, cannabinoide, THC, carboxi-THD, heroína, codeína, morfina, 6-monoacetilmorfina (MAM) , oxicodona, 3, 4-metilendoxianfetamina (MDA) y 3, 4-metilendioximetanfetamina (MDMA) , o

en el que la droga o metabolito de la misma, el medicamento de prescripción o metabolito del mismo o el analgésico

o metabolito del mismo es un opioide, cannabinoide, AINE, esteroide, anfetamina, benzodiacepina, barbitúrico, tricíclico o efedrina, o metabolito de los mismos.

14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la muestra de estructura queratinizada comprende pelo, una uña de los dedos de la mano o una uña de los dedos del pie.

15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la muestra de pelo es lavada.