Péptidos o análogos de péptidos para modulación de la fijación de una proteína PDZ y una proteína PL.

Un péptido de fusión o análogo peptídico del mismo para modulación de la fijación de una proteína PDZ y unaproteína PL que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos transmembranales transportadores capaz de facilitar la entrada de un péptido enlazado a ella en una célula a través de la membrana plasmática,

(ii) una secuencia peptídica polienlazadora flexible opcional, y

(iii) una secuencia peptídica del terminal carboxilo que comprende un motivo de fijación de dominio PDZ en elterminal C, comprendiendo la secuencia del motivo de fijación de dominio PDZ

X*-S/T-D/E-V/I/L, en donde X* es cualquier aminoácido no aromático.

Péptidos o análogos de péptidos para modulación de la fijación de una proteína PDZ y una proteína PL

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a péptidos y análogos de péptidos, y métodos para utilización de tales composiciones para regular las actividades de células del sistema hematopoyético. En un aspecto, la invención proporciona métodos de modulación del metabolismo (v.g., la activación) de las células hematopoyéticas (v.g., células T y células B) por antagonismo de una interacción entre una proteína que contiene un dominio PDZ y una proteína que se fija a un dominio PDZ. En un aspecto, aquélla se refiere a péptidos de fusión que contienen una secuencia de aminoácidos correspondiente al término carboxilo de un receptor de superficie expresado por una célula hematopoyética y una secuencia transportadora transmembranal; tales péptidos de fusión son útiles en la regulación de las células hematopoyéticas por inhibición de la activación celular.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los dominios PDZ de las proteínas se nombran según tres proteínas prototípicas: PSD95 (proteína del disco grande de Drosophila y proteína Zonula Occludin 1 (Gomperts et al., 1996, Cell 84: 659-662) . Las proteínas que contienen el

dominio PDZ están implicadas en la formación de sinapsis por organización de receptores de neurotransmisores transmembranales por interacciones intracelulares. Los dominios PDZ contienen la secuencia de firma GLGF. En el sistema nervioso, las proteínas típicas que contienen dominios PDZ contienen tres dominios PDZ, un dominio SH3 y un dominio guanilato-quinasa. Ejemplos de proteínas intracelulares que contienen dominios PDZ incluyen LIN-2, LIN-7 y LIN-10 en la pre-sinapsis, y PSD95 en la post-sinapsis.

Se ha demostrado que los dominios PDZ se fijan a los términos carboxilo de las proteínas transmembranales en las células neuronales. Songyang et al. consignaron que las proteínas capaces de fijar dominios PDZ contienen una secuencia motivo en el terminal carboxilo de E-S/T-X-V/I (Songyang et al., 1997, Science 275: 73) . Estudios de cristalografía de rayos X han revelado los puntos de contacto entre la secuencia motivo y los dominios PDZ (Doyle et al., 1996, Cell 88: 1067-1076) . Si bien la interacción entre los dominios PDZ y los canales iónicos en las neuronas se han estudiado extensamente, tales interacciones han sido objeto de estudios limitados en otros sistemas biológicos, especialmente en el sistema hematopoyético.

El sistema hematopoyético está compuesto de diferentes tipos de células que realizan distintas funciones. Muchas de sus diversas funciones requieren el movimiento coordinado de receptores de superficie celular que incluyen canales iónicos, moléculas superficiales de adhesión para coordinar la interacción célula-célula, y receptores de 30 citoquinas. A pesar de sus diversas actividades funcionales, se cree que todas las células hematopoyéticas se desarrollan a partir de una célula madre hematopoyética multipotente de la médula ósea. Se ha demostrado que dicha célula madre expresa un marcador de superficie denominado CD34. Durante la diferenciación, la célula madre da lugar a células progenitoras en cada uno de varios linajes específicos de células hematopoyéticas. Las células progenitoras sufren luego una serie de cambios morfológicos y funcionales para producir células hematopoyéticas asignadas funcionalmente maduras.

Entre las funciones desempeñadas por las células hematopoyéticas, ciertos tipos de células están implicados sólo en la inmunidad. Por ejemplo, los linfocitos, que incluyen células T, células B y células agresoras naturales (NK) , son efectores en las respuestas inmunitarias. Monocitos y granulocitos (es decir, neutrófilos, basófilos y eosinófilos) juegan un papel en formas de defensa inespecíficas. A los linfocitos, monocitos y granulocitos se hace referencia colectivamente como células blancas de la sangre o leucocitos. Por otra parte, otras células hematopoyéticas realizan funciones que no están relacionadas con el sistema inmunitario. Por ejemplo, los eritrocitos están implicados en el transporte de gases, y las células de la serie trombocítica están implicadas en la coagulación de la sangre.

Las células T y las células B reconocen antígenos y generan una respuesta inmune. Las células T reconocen los 45 antígenos por receptores heterodímeros de la superficie denominados el receptor de células T (TCR) . El TCR está asociado por una serie de polipéptidos a los que se hace referencia colectivamente como complejo CD3. Las células B reconocen los antígenos por inmunoglobulinas de la superficie (Ig) , que son también moléculas secretoras. Adicionalmente, se han identificado un gran número de receptores co-estimulantes de la superficie en las células T y las células B, que aumentan la activación celular durante la activación inducida por el antígeno.

Además del complejo receptor antígeno de las células T/CD3 (TCR/CD3) , otras moléculas expresadas por las células T que median una señal de activación incluyen, pero sin carácter limitante, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD18, CD27, CD28, CD43, CD45, CD152 (CTLA-4) , CD154, MHC clase I, MHC clase II, CDw137 (4-1BB) , CDw150, y análogos (Barclay et al., The Leucocyte Antigen Facts Book, 1997, segunda edición, Academic Press; Leucocyte Typing, 1984, Bernard et al. (eds.) , Springer-Verlag; Leukocyte Typing II, 1986, Reinherz et

al. (eds.) , Springer-Verlag; Leukocyte Typing III, 1987, McMichael (ed.) , Oxford University Press; Leukocyte Typing IV, 1989, Knapp et al. (eds.) , Oxford University Press; CD Antigens, 1996, VI Internat. Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens. http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/prow) . A los antígenos de la superficie celular que operan junto con TCR/CD3 se hace referencia en la técnica a menudo como coreceptores.

Se han generado anticuerpos específicos contra la totalidad de los antígenos de superficie de las células T arriba mencionados. Otras moléculas que se fijan a los receptores de superficie de las células T arriba mencionados incluyen derivados de anticuerpos fijadores de antígeno tales como dominios variables, péptidos, superantígenos, y sus ligandos naturales tales como CD58 (LFA-3) para CD2, HIV gp120 para CD4, CD27L para CD27, CD80 o CD86 para CD28 o CD152, ICAM1, ICAM2 e ICAM3 para CD11a/CD18, 4-1BBL para CDw137.

Moléculas de activación expresadas por las células B incluyen, pero sin carácter limitante, Ig de superficie, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD40, CD45, CD80, CD86 e ICAM1. Análogamente, ligandos naturales de estas moléculas y anticuerpos dirigidos a ellos así como derivados de anticuerpos pueden utilizarse para administrar una señal de activación a las células B.

Sin embargo, antes de la presente invención, no se sabía que la transducción de señales después de la estimulación de cualquier receptor de leucocitos estaba mediada por interacciones de receptores con proteínas que contenían dominios PDZ. Por tanto, ni siquiera se contemplaba en la técnica que una interferencia de interacciones receptor de superficie de los leucocitos/dominio PDZ pudiera regular la activación de los leucocitos.

El documento WO 98/23781 A1 da a conocer péptidos que modulan la fijación de una proteína PDZ que comprende una secuencia D-X-V de fijación del dominio PDZ C-terminal.

3. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención da a conocer un péptido de fusión o análogo peptídico del mismo para modulación de la fijación de una proteína PDZ y una proteína PL que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos transmembranales transportadores capaz de facilitar la entrada de un péptido enlazado a ella en una célula a través de la membrana plasmática,

(ii) una secuencia peptídica polienlazadora flexible opcional, y

(iii) una secuencia peptídica del terminal carboxilo que comprende un motivo de fijación de dominio PDZ en el terminal C, comprendiendo la secuencia del motivo de fijación del dominio PDZ

X*-S/T-D/E-V/I/L, en donde X* es cualquier aminoácido no aromático.

Realizaciones preferidas de la invención se describen en las reivindicaciones del apéndice.

Se describe también en esta memoria un método de modulación de una función biológica de una célula, v.g., una célula endotelial o célula hematopoyética (tal como un leucocito, v.g. célula T o célula B) , por introducción en la célula de un antagonista que inhibe la fijación de una proteína PDZ y una proteína PL en la célula, o un agonista que mejora la fijación de una proteína PDZ y una proteína PL en la célula. En diversas... [Seguir leyendo]

1. Un péptido de fusión o análogo peptídico del mismo para modulación de la fijación de una proteína PDZ y una proteína PL que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos transmembranales transportadores capaz de facilitar la entrada de un péptido enlazado a ella en una célula a través de la membrana plasmática,

(ii) una secuencia peptídica polienlazadora flexible opcional, y

(iii) una secuencia peptídica del terminal carboxilo que comprende un motivo de fijación de dominio PDZ en el terminal C, comprendiendo la secuencia del motivo de fijación de dominio PDZ

X*-S/T-D/E-V/I/L, en donde X* es cualquier aminoácido no aromático.

2. El péptido de fusión o análogo peptídico de la reivindicación 1, en donde la actividad de modulación funciona para inhibir la fijación de la proteína PDZ a la proteína PL.

3. El péptido o análogo peptídico de fusión de la reivindicación 2, en donde la secuencia C-terminal comprende cualquiera de las secuencias E-S-D-V o E-T-D-V.

4. El péptido o análogo peptídico de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia del péptido del terminal carboxilo comprende de 4 a 15 aminoácidos.

5. El péptido o análogo peptídico de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de aminoácidos del transportador transmembranal se selecciona de (a) tat derivado de HIV, (b) antenapedia de Drosophila, y (c) VP22 del herpes simple.

6. El péptido o análogo peptídico de fusión de la reivindicación 5, en donde la secuencia del péptido del terminal carboxilo comprende de 4 a 15 aminoácidos.

7. El péptido o análogo peptídico de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de aminoácidos del transportador transmembranal es un péptido tat que comprende la secuencia GYGRKKRRQRRRG.

8. El péptido o análogo peptídico de fusión de la reivindicación 3, en donde la secuencia de aminoácidos del transportador transmembranal es una secuencia tat derivada de HIV, y en donde la secuencia del péptido del terminal carboxilo contiene de 4 a 15 aminoácidos.