Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que contienen hemaglutinina producida dentro de una planta.

Un método para producir partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta,

que comprende:

a) introducir un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una hemaglutinina deinfluenza (HA) operativamente enlazada a una región reguladora activa en la planta dentro de la planta, o en unaporción de la misma,

b) incubar la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo así las VLP,

c) cosechar la planta, y

d) purificar las VLP, en donde las VLP están en un intervalo de tamaño de 80 - 300 nm.

Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que contienen hemaglutinina producida dentro de una planta Campo de la invención La presente invención se relaciona con la producción de partículas similares a virus. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la producción de partículas similares a virus que comprenden antígenos de influenza.

Antecedentes de la invención La influenza es la causa principal de muerte en seres humanos debido a un virus respiratorio. Los síntomas comunes incluyen fiebre, dolor de garganta, respiración entrecortada y dolor muscular, entre otros. Durante la temporada de gripe, los virus de la influenza infectan 10 - 20% de la población en todo el mundo, conduciendo a 250

- 500.000 muertes anualmente.

Los virus de la influenza son virus encapsulados que brotan de la membrana plasmática de células de mamíferos infectados. Se clasifican en tipos A, B o C, con base en las nucleoproteínas y antígenos de matriz de proteína presentes. Los virus de la influenza tipo A pueden además dividirse en subtipos de acuerdo con la combinación de glicoproteínas de superficie de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) presentes. La HA controla la capacidad del virus para unirse y penetrar la célula huésped. La NA remueve residuos de ácido siálico terminal de las cadenas de glicano en la célula huésped y las proteínas de la superficie viral, lo cual evita la agregación viral y facilita la movilidad del virus. Actualmente, se reconocen los subtipos 16 HA (H1 - H16) y 9 NA (N1 - N9) . Cada virus de influenza del tipo A presenta un tipo de glicoproteína HA y un tipo de glicoproteína NA. Generalmente, cada subtipo exhibe una especificidad de especie; por ejemplo, se sabe que todos los subtipos de HA y NA infectan aves, mientras que sólo los subtipos H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 y N7 han demostrado que infectan seres humanos (Horimoto 2006; Suzuki 2005) . Los virus de la influenza que comprenden H5, H7 y H9 se consideran las formas más altamente patógenas de virus de influenza A, y es más probable que causen futuras pandemias.

Las pandemias de influenza son usualmente causadas por virus de influenza altamente transmisibles y virulentos, y pueden conducir a niveles elevados de enfermedad y muerte a escala mundial. El surgimiento de nuevos subtipos de influenza A dio como resultado 4 pandemias mayores en el siglo 20. La gripe española, causada por un virus H1N1, en 1918 - 1919 condujo a la muerte a más de 50 millones de personas en todo el mundo entre 1917 y 1920. Actualmente, el riesgo de surgimiento de un nuevo subtipo, o de la transmisión a seres humanos de un subtipo endémico en animales, está siempre presente. De interés especial es una forma altamente virulenta de una influenza aviar (también llamada “gripe aviar”) , brotes de los cuales han sido reportados en varios países alrededor del mundo. En muchos casos, esta gripe aviar puede resultar en tasas de mortalidad cercanas al 100% en un lapso de 48 horas. La diseminación del virus de influenza aviar (H5N1) , identificada primero en Hong Kong en 1997, a otros países asiáticos y europeos se ha postulado que está relacionado con los patrones migratorios de aves silvestres.

El método actual para combatir la influenza en seres humanos es por medio de vacunación anual. La vacuna es usualmente una combinación de varias cepas que se predice son las cepas dominantes para la “gripe de la temporada” entrante. La predicción es coordinada por la Organización Mundial de la Salud. Generalmente, el número de dosis de vacunas producidas cada año no es suficiente para vacunar a la población mundial. Por ejemplo, Canadá y los Estados Unidos obtienen suficientes dosis de vacunas para inmunizar alrededor de un tercio de su población, mientras sólo 17% de la población de la Unión Europea pueden ser vacunados. Es evidente que la producción actual en todo el mundo de vacuna contra la influenza podría ser insuficiente frente a una pandemia de gripe en todo el mundo. Incluso si la producción anual necesaria pudiera de algún modo cumplirse en un año determinado, las cepas dominantes cambian de año en año, de modo que la acumulación en momentos de menos necesidad en el año no es práctica. La producción económica a gran escala de una vacuna efectiva contra la influenza es de interés significativo tanto para el gobierno como para la industria privada por igual.

Las reservas virales para su uso en vacunas son producidas en huevos fertilizados. Las partículas virales son cosechadas, y para una vacuna viral inactivada, interrumpidas por medio de detergente para inactivarlas. Las vacunas vivas atenuadas se elaboran a partir de virus de la influenza que fueron adaptados para crecer a baja temperatura lo cual significa que a temperatura corporal normal, se atenúa la vacuna. Tal vacuna se autoriza en los Estados Unidos para su uso en individuos comprendidos entre 5 y 49 años de edad. Las vacunas de virus enteros inactivados no causan ningún daño por la inactivación con agentes químicos y han sido producidas en huevos embrionarios o en cultivos de células de mamíferos. Todos estos tipos de vacuna muestran algunas ventajas y desventajas específicas. Una ventaja de vacunas derivadas de virus enteros es el tipo de inmunidad inducida por tales vacunas. En general, las vacunas divididas inducen una fuerte respuesta de anticuerpos mientras las vacunas elaboradas a partir de virus enteros inducen tanto una respuesta de anticuerpos (humoral) como celular. Aun cuando una respuesta de anticuerpos funcional es un criterio para obtener la licencia que se correlaciona con la protección inducida por una vacuna, existe una evidencia cada vez mayor de que una respuesta de células T es también importante en la inmunidad contra influenza - esto puede también proporcionar mejor protección en los ancianos.

Con el fin de inducir una respuesta inmune celular, se desarrollaron vacunas elaboradas a partir de virus completos. Debido a la alta patogenicidad de la cepa de la influenza (por ejemplo, H5N1) , estas vacunas son producidas en una instalación BL3+. Para cepas de influenza altamente patógenas tales como H5N1, algunos fabricantes han modificado la secuencia génica de la hemaglutinina con el fin de reducir la patogenicidad de la cepa de la influenza y volverla no virulenta y más fácilmente producida en huevos embrionarios o cultivos celulares de mamíferos. Otros también utilizan cepas de influenza nuevamente mezcladas en las cuales las secuencias genéticas para las proteínas de hemaglutinina y neuraminidasa se clonan en una cepa donadora de influenza poco patógena de alto rendimiento (A/PR/8/34; Quan F-S et al, 2007) . Aunque estos métodos pueden producir vacunas útiles, no proporcionan una solución a la necesidad de una producción rápida, de bajo costo, y en gran volumen de vacunas a escala necesaria para satisfacer la necesidad global en un año normal, y es casi seguro que sería insuficiente frente a una pandemia.

Al utilizar esta tecnología genética inversa, se podría necesitar también mutar la secuencia genética de la proteína HA para hacerla no virulenta. Para cepas de influenza altamente patógenas, la producción de vacunas a partir de virus completos requiere ya sea procedimientos de confinamiento o que las vacunas resultantes no coincidan exactamente con la secuencia genética del virus circulante. En el caso de vacunas vivas atenuadas, existe aún un riesgo de que la vacuna administrada pueda recombinarse con un virus de la influenza del huésped, conduciendo a un nuevo virus de influenza.

Aunque este método mantiene el epítopo antigénico y las modificaciones después de la traducción, existen una cantidad de inconvenientes con este método, incluyendo el riesgo de contaminación debido al uso de virus completos y rendimientos variables dependiendo de la cepa del virus. Pueden presentarse niveles de protección por debajo del óptimo por la heterogeneidad genética en el virus debido a su introducción en los huevos. Otras desventajas incluyen planificación extensa para obtener los huevos, riesgos de contaminación debidos a compuestos químicos utilizados en la purificación, y largos periodos de producción. También, personas hipersensibles a proteínas del huevo no pueden ser candidatas aptos para recibir la vacuna.

En el caso de una pandemia, la producción de vacunas divididas se limita por la necesidad para adaptar la cepa para ser cultivada en huevos y los rendimientos de producción variable logrados. Aunque esta tecnología ha sido utilizada durante años para la producción de vacunas de temporada, difícilmente puede responder en un plazo razonable a una pandemia y la capacidad de fabricación a nivel mundial es limitada.

Para evitar... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta, que comprende: a) introducir un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una hemaglutinina de

influenza (HA) operativamente enlazada a una región reguladora activa en la planta dentro de la planta, o en una porción de la misma, b) incubar la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo así las VLP, c) cosechar la planta, y d) purificar las VLP, en donde las VLP están en un intervalo de tamaño d.

80. 300 nm.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16.

3. El método de la reivindicación 2, en donde en la etapa de introducción (etapa a) , el ácido nucleico se expresa en forma transitoria en la planta.

4. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde en la etapa de introducción (etapa a) , el ácido nucleico se expresa en forma estable en la planta.

5. Una partícula similar a un virus (VLP) producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una proteína de hemaglutinina del virus de la influenza (HA) y uno o más de un lípido derivado de una planta.

6. La VLP de la reivindicación 5, en donde la proteína HA de influenza es Indonesia H5.

7. Una composición que comprende una dosis efectiva de la VLP de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 para inducir una respuesta inmunológica y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Una VLP producida por medio del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la VLP de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde la HA del virus de la influenza comprende N-glicanos, o N-glicanos modificados específicos de la planta.

9. La VLP de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o la reivindicación 8, o la composición de la reivindicación 7, para uso en la inducción de inmunidad para una infección causada por virus de la influenza en un individuo.

10. La VLP de la reivindicación 9, en donde la VLP es adecuada para administración oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.

11. Una composición que comprende una dosis efectiva de la VLP de la reivindicación 8 para inducir una respuesta inmune, y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. La composición de la reivindicación 11 para uso en la inducción de inmunidad para una infección causada por virus de la influenza en un individuo.

13. La composición de la reivindicación 12, en donde la composición es adecuada para administración oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.

14. Un alimento suplementado que comprende la VLP como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 u

8.

Fig. 9

>BHB940420 I gb : AF071776 I Símbolo : HA I Nombre : precursor de hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A/pollo/Nueva York/1995 I Cromosoma : 4 I Subtipo : H7 I Huésped : Aviar

Fig. 10A

Fig. 10B Subtipo H3 (SEQ ID NO: 13) >BHB2107299 I gb : EF473574 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /Tejas/32/2003 I Segmento : 4 I Subtipo : H3 I Huésped : Humano

Fig. 10C

>BHB1050162 I gb : DQ021859 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /ánade real/MN/33/00 I Segmento : 4 I Subtipo : H4 I Huésped : Aviar

Fig. 10D

>BHB950029 I gb : AF501235 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /pato/Shanghái/1/2000 I Segmento : 4 I Subtipo : H5 I Huésped : Aviar

Fig. 10E

>BHB1049778 I gb : DQ021667 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /ánade de cola larga/TX/828189/02 I Segmento : 4 I Subtipo : H6 I Huésped : Aviar

Fig. 10F

>gi I 221317 I dbj I D90304.1 I FLAHAH8N4 Virus de influenza A (A /Pavo/Ontario/6118/68 (H8N4) I gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10G

>BHB954830 I gb : AMO87218 I Símbolo : HA I Nombre : hemaglutinina I Organismo : Virus de influenza A A /pato cuchareta/Irán/G54/03 I Segmento : 4 I Subtipo : H9 I Huésped : Aviar

Fig. 10H

>gi I 324365 I gb I M21647.1 I FLAMS84HA Virus de influenza A (A /pollo/Alemania/N/1949 (H10N7) I precursor de hemaglutinina, gen, cds completo

Fig. 10I

>gi I 221307 I dbj I D90306.1 I FLAHAH11N Virus de influenza A (A /pato/Inglaterra/56/ (H11N6) ) gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10J

>gi I 221309 I dbj I D90307.1 I FLAHAH12N Virus de influenza A (A /pato/Alberta/60/76 (H12N5) ) gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10K

>gi I 221311 I dbj I D90308.1 I FLAHAH13N Virus de influenza A (A /Gaviota/Mar y land/704/77 (H13N6) ) gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10L

>gi I 324045 I gb I M35997.1 I FLAH1424 Virus de influenza A A /Ánade real/Gurjev/263/82 hemaglutinina subtipo H14 gen

Fig. 10M

>gi I 1226068 I gb I L43916.1 I FLAHEMAC influenza A/pato/Australia/341/83 (H15N8) ) ARNm de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10N

Subtipo H16 (SEQ ID NO: 25)

>gi I 56425020 I gb I AY68489.1 I Virus de influenza A (A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3) ) gen de hemaglutinina (HA) , cds completo

Fig. 10O Influenza B (SEQ ID NO: 26)

>gi I 325175 I gb I K00423.1 I FLBHAZO influenza B/Lee/40, hemaglutinina (seg 4) , segmento completo

Fig. 10P

Influenza C (SEQ ID NO: 27)

>gi I 325317 I gb I M17868.1 I FLCHAJO influenza C/Johannesburgo/66, ARN de hemaglutinina esterasa (seg 4) , cds completo