Oxalato-descarboxilasa cristalizada y métodos de uso.

Composición farmacéutica que comprende cristales de oxalato-descarboxilasa,

donde los cristales de oxalatodescarboxilasaestán reticulados con un agente reticulante y tienen una actividad que corresponde al menos aaproximadamente el 100% de la actividad de una forma soluble de la oxalato-descarboxilasa.

Oxalato-descarboxilasa cristalizada y métodos de uso ANTECEDENTES

El ácido oxálico es un ácido dicarboxílico de fórmula HO2C-CO2H. En los organismos biológicos, el ácido oxálico está presente principalmente en forma de oxalato, que es la sal del ácido oxálico. El oxalato se encuentra en ciertos alimentos, por ejemplo espinacas, ruibarbo, fresas, arándanos, nueces, cacao, chocolate, manteca de cacahuete, sorgo y té. El oxalato es también un producto metabólico final en humanos y otros mamíferos. Es secretado por los riñones en la orina. En combinación con el calcio, el ácido oxálico forma un producto insoluble, oxalato de calcio, que es el compuesto químico más frecuente hallado en los cálculos renales.

Dado que los mamíferos no sintetizan enzimas que degraden el oxalato, los niveles de oxalato en un individuo normalmente se mantienen bajo control por la excreción y la baja absorción del oxalato de los alimentos. Una concentración elevada de oxalato está asociada a diversas patologías, como hiperoxaluria primaria, hiperoxaluria entérica e hiperoxaluria idiopática (Leumann y col., Nephrol. Dial. Transplant. 14:2556-2558 (1999) y Earnest, Adv. Internal Medicine 24:407-427 (1979) ) . Niveles altos de oxalato pueden deberse a un consumo excesivo de oxalato con los alimentos, a una hiperabsorción de oxalato en el tracto gastrointestinal y a anomalías de la producción de oxalato. La hiperabsorción de oxalato en el colon y el intestino delgado puede asociarse a enfermedades intestinales, incluyendo hiperabsorción provocada por enfermedades de malabsorción de ácido biliar y grasas; curación por resección; y, por ejemplo, por esteatorrea debida a enfermedad celíaca, insuficiencia pancreática exocrina, enfermedad intestinal y enfermedad hepática.

La hiperoxaluria, o aumento de la excreción urinaria de oxalato, está asociada a diversos problemas de salud relacionados con el depósito de oxalato de calcio en el tejido renal (nefrocalcinosis) o en el tracto urinario (por ejemplo, cálculos renales, urolitiasis y nefrolitiasis) . El oxalato de calcio también se puede depositar por ejemplo en los ojos, vasos sanguíneos, articulaciones, huesos, músculos, corazón y otros órganos importantes, provocando daños en los mismos (Véase, por ejemplo, Leumann y col., J. Am. Soc. Nephrol. 12:1986 1993 (2001) y Monico y col., Kidney lnternational 62:392 400 (2002) ) . Los efectos de un nivel elevado de oxalato se pueden manifestar en diversos tejidos. Por ejemplo, su depósito en vasos sanguíneos pequeños provoca dolorosas úlceras en la piel que no se curan, en la médula ósea provocan anemia, en el tejido óseo causan fracturas o afectan al crecimiento en niños y en el corazón producen anomalías del ritmo cardíaco o una función cardíaca deficiente.

Anand R. y col., Biochemistr y 2002, 41, 7659-7669, se refieren a la estructura de la oxalato-descarboxilasa de Bacillus subtillis con una resolución de 1, 75 Å. La US 2004/0234514 A1 da a conocer composiciones y métodos para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con el oxalato.

Los métodos existentes para tratar niveles elevados de oxalato no son siempre eficaces y muchos pacientes con hiperoxaluria primaria requieren diálisis intensas y trasplantes de órganos. Las terapias existentes para diversas hiperoxalurias incluyen tratamiento con piridoxina a altas dosis, tratamiento con ortofosfato, magnesio, hierro, aluminio, citrato de potasio, colestiramina y glicosaminoglucano, así como regímenes para ajustar la dieta y la ingesta de fluidos, diálisis e intervención quirúrgica, como trasplante renal y hepático. Estas terapias (por ejemplo dieta baja en oxalatos o baja en grasas, piridoxina, calcio apropiado y nivel elevado de líquidos) sólo son parcialmente eficaces y pueden tener efectos secundarios nocivos no deseables, por ejemplo efectos gastrointestinales de la complementación de ortofosfato, magnesio o colesteramina y riesgo de diálisis y cirugía. Por consiguiente, se requieren métodos para eliminar con seguridad el oxalato del cuerpo. Además, los métodos que degradan el oxalato para reducir los niveles de oxalato en una muestra biológica resultan ventajosos en comparación con una terapia que, por ejemplo, únicamente bloquee la absorción o aumente el aclaramiento de oxalato.

SUMARIO

La invención proporciona cristales de oxalato-descarboxilasa (“OXDC”) y formas reticuladas de los mismos (“CLEC”) y su utilización para el tratamiento de trastornos asociados al oxalato, por ejemplo hiperoxaluria. En una realización, la oxalato-descarboxilasa cristalina puede ser administrada a un mamífero, por ejemplo vía oral o directamente en el estómago, para disminuir los niveles de oxalato y/o para reducir el daño causado por los depósitos de oxalato de calcio en el mamífero. También se dan a conocer métodos para producir cristales de proteínas de extractos celulares. Además, se dan a conocer composiciones, por ejemplo composiciones farmacéuticas, que incluyen cristales de oxalatodescarboxilasa (“OXDC”) y formas reticuladas de los mismos (“CLEC”) .

En un aspecto, la invención describe cristales de oxalato-descarboxilasa reticulados. El agente reticulante puede ser multifuncional y, en determinadas realizaciones, se trata de un agente bifuncional, tal como glutaraldehído. En determinadas realizaciones, los cristales de oxalato-descarboxilasa se reticulan con glutaraldehído en una concentración que no altera esencialmente la actividad enzimática, por ejemplo a una concentración de al menos aproximadamente un 0, 02% (p/v) . En algunas realizaciones, el nivel de reticulación del cristal de oxalato-descarboxilasa es equivalente al obtebido por tratamiento con un 0, 02% (p/v) de glutaraldehído. El nivel de reticulación se puede

determinar por métodos conocidos en la técnica o descritos en este documento, por ejemplo determinando el nivel de lixiviación de proteínas, tal como se da a conocer en los Ejemplos 10-11.

La invención también describe cristales de oxalato-descarboxilasa, por ejemplo cristales de oxalato-descarboxilasa de alta actividad, por ejemplo de al menos aproximadamente un 100%, 200%, 300%, 400% o 500%, en comparación con la oxalato-descarboxilasa soluble.

Además, la invención también describe cristales de oxalato-descarboxilasa estabilizados, por ejemplo reticulados, donde dicho cristal estabilizado mantiene una actividad y/o estabilidad bajo condiciones ácidas al menos 2 a 3 veces mayor que la actividad y/o estabilidad mantenida por una oxalato-descarboxilasa bajo condiciones ácidas similares (por ejemplo, un pH ácido de aproximadamente 2 a 3) . En algunas realizaciones, el cristal de oxalato-descarboxilasa estabilizado es al menos un 200%, 300% o 400% más activo y/o estable que una oxalato-descarboxilasa soluble bajo condiciones ácidas.

La invención también da a conocer un cristal de oxalato-descarboxilasa estabilizado, por ejemplo reticulado, donde dicho cristal estabilizado mantiene una actividad y/o estabilidad, en presencia de una proteasa, al menos 2 a 3 veces mayor que la actividad y/o estabilidad mantenida por una oxalato-descarboxilasa soluble bajo condiciones similares. En algunas realizaciones, el cristal de oxalato-descarboxilasa estabilizado es al menos un 200%, 300% o 400% más activo y/o estable que una oxalato-descarboxilasa soluble en presencia de una proteasa. La proteasa se puede seleccionar, por ejemplo, de entre una o más de, por ejemplo, pepsina, quimotripsina o pancreatina. En algunas realizaciones, la actividad de la oxalato-descarboxilasa estabilizada o soluble se mide después de exponer el cristal estabilizado o la oxalato-descarboxilasa soluble a condiciones ácidas y/o a una proteasa durante un tiempo predeterminado, por ejemplo al menos una, dos, tres, cuatro o cinco horas (por ejemplo tal como se describe en los ejemplos aquí mostrados) .

En un aspecto relacionado, la invención da a conocer un cristal de oxalato-descarboxilasa reticulado que es esencialmente activo y estable bajo condiciones variables de pH (por ejemplo, aproximadamente pH 2, 5 o 3 a 7, 5 u 8, 5) y/o en presencia de una proteasa, por ejemplo una proteasa seleccionada de entre una o más de pepsina, quimotripsina o pancreatina. En algunas realizaciones, el cristal reticulado mantiene una actividad al menos 2 a 3 veces mayor que la actividad mantenida por una oxalato-descarboxilasa soluble bajo condiciones ácidas (por ejemplo un pH ácido de aproximadamente 2 a 3) y en presencia de una proteasa, tal como se describe aquí. En otras realizaciones, el cristal de oxalato-descarboxilasa estabilizado es al menos un 200%, 300% o 400% más estable que una oxalato-descarboxilasa soluble bajo condiciones ácidas (por ejemplo un... [Seguir leyendo]

1. Composición farmacéutica que comprende cristales de oxalato-descarboxilasa, donde los cristales de oxalatodescarboxilasa están reticulados con un agente reticulante y tienen una actividad que corresponde al menos a aproximadamente el 100% de la actividad de una forma soluble de la oxalato-descarboxilasa.

2. Cristales de oxalato-descarboxilasa para su utilización en un tratamiento de un trastorno asociado al oxalato en un mamífero, seleccionándose dicho trastorno entre hiperoxaluria, hiperoxaluria primaria, hiperoxaluria entérica, hiperoxaluria idiopática, intoxicación por etilenglicol (oxalato) , enfermedad idiopática por cálculos urinarios, insuficiencia renal (incluyendo insuficiencia renal progresiva, crónica o terminal) , esteatorrea, malabsorción, enfermedad ileal, vulvodinia, trastornos de la conductancia cardíaca, enfermedad inflamatoria intestinal, fibrosis quística, insuficiencia pancreática exocrina, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, nefrocalcinosis, urolitiasis y nefrolitiasis, opcionalmente agudos o crónicos.

3. Cristales de oxalato-descarboxilasa para su uso según la reivindicación 2, donde el trastorno se relaciona con una función renal o hepática.

4. Cristales de oxalato-descarboxilasa para su uso según la reivindicación 2, donde el trastorno se selecciona de entre el grupo consistente en hiperoxaluria primaria, hiperoxaluria entérica, hiperoxaluria idiopática, intoxicación por etilenglicol, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal, urolitiasis, nefrolitiasis y un trastorno renal.

5. Utilización de una composición de cristales de oxalato-descarboxilasa en un dispositivo extracorpóreo, caracterizada porque el dispositivo extracorpóreo no está dentro del cuerpo y porque permite el contacto de un fluido corporal con dichos cristales de descarboxilasa.

6. Utilización según la reivindicación 5, caracterizada porque el dispositivo es un dispositivo de diálisis o una membrana de un dispositivo de diálisis.

7. Cristales de oxalato-descarboxilasa para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizados porque están enlazados de forma covalente mediante un agente reticulante.

8. Cristales de oxalato-descarboxilasa para su utilización según la reivindicación 7, caracterizados porque son activos y estables en el tracto gastrointestinal del mamífero.

9. Cristales de oxalato-descarboxilasa para su utilización según la reivindicación 7, caracterizados porque son activos y estables a valores de pH de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8.

10. Cristales de oxalato-descarboxilasa para su utilización según la reivindicación 7, caracterizados porque están previstos para ser administrados vía oral.

11. Cristales de oxalato-descarboxilasa para su utilización según la reivindicación 7, para reducir el oxalato en al menos un 15%.

12. Utilización según la reivindicación 5 o 6, caracterizada porque los cristales de oxalato-descarboxilasa están enlazados de forma covalente mediante un agente reticulante.

13. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque los cristales de oxalato-descarboxilasa son activos y estables a valores pH de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8.

14. Utilización según la reivindicación 12 para reducir el oxalato en al menos un 15%.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque los cristales de oxalatodescarboxilasa reticulados tienen una actividad correspondiente al menos a aproximadamente un 150% de la actividad de la forma soluble de la oxalato-descarboxilasa.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, caracterizada porque los cristales de oxalatodescarboxilasa reticulados están reticulados con glutaraldehído.

Tratamiento con OXDC-CLEC

Oxalato en Dieta Rica en Oxalato orina (umol/24 h)

Aclaramientode Creatinina (ml/h)

NºSupervivientes %ActividadResidual % ActividadResidual