Moléculas de unión proteináceas que comprenden marcadores de purificación.

Una inmunoglobulina que comprende al menos dos dominios variables,

donde un dominio variable incluyela región completa de unión al antígeno de una rama de la molécula de inmunoglobulina, donde un dominiovariable se une a una molécula diana, y donde al menos otro dominio variable comprende un marcador depurificación, donde el dominio variable que comprende el marcador de purificación no se une a la moléculadiana, y donde dicho marcador de purificación está comprendido en la región CDR del otro dominio variablemencionado y se selecciona entre un marcador de histidina, un marcador de hexahistidina, un marcadorStrep, un marcador myc, un marcador Flag y un marcador V5, o una variante sustancialmente idéntica deestos la cual retiene la propiedad del marcador de purificación de unirse específicamente a un resto quereconoce de manera específica el marcador de purificación y donde la inmunoglobulina es monovalenterespecto a la unión de la molécula diana pero retiene las propiedades de una inmunoglobulina completa enlo que respecta al tamaño y presencia del dominio Fc.

Moléculas de unión proteináceas que comprenden marcadores de purificación Antecedentes de la invención Las inmunoglobulinas, tales como los anticuerpos, constituyen un interés continuo y creciente para la industria farmacéutica. Más de 20 anticuerpos monoclonales (mAb) están comercializados y más de 100 están en ensayos clínicos. En la última década, se han diseñado numerosos derivados y fragmentos de inmunoglobulinas que tienen ciertas propiedades diferentes en comparación con los anticuerpos e inmunoglobulinas convencionales, las cuales pueden ser convenientes para ciertas aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. Algunos ejemplos son los fragmentos de anticuerpos recombinantes (tales como los fragmentos de anticuerpos monovalentes clásicos (Fab, scFv) ) o variantes manipuladas (diacuerpos, triacuerpos, minicuerpos y anticuerpos con un único dominio) , algunos de los cuales están surgiendo en la actualidad como alternativas fiables. Las variantes y fragmentos de este tipo normalmente retienen la afinidad por la diana de las inmunoglobulinas completas pero a menudo se pueden producir de manera más económica. Además, se han desarrollado nuevas estructuras de base que presentan proteínas “similares a los anticuerpos”, las cuales, asimismo, poseen ciertas propiedades diferentes en comparación con los anticuerpos e inmunoglobulinas convencionales.

Para ciertas aplicaciones terapéuticas, sería conveniente disponer de una interacción antígeno-anticuerpo monovalente, es decir, una inmunoglobulina, u otra estructura de base, con tan solo un dominio variable que se une a una molécula diana de interés. Se ha observado que algunas IgG se entrecruzan con los receptores diana y de este modo mimetizan el efecto del ligando natural. El entrecruzamiento puede provocar la activación del receptor (p. ej., la fosforilación del receptor) . Por el contrario, los Fab monovalentes derivados del mismo anticuerpo no dan lugar al entrecruzamiento con el receptor y, si la diana es el epítopo adecuado, evita la unión del ligando natural. Por lo tanto, mientras la IgG actúa como un agonista, el fragmento Fab del mismo anticuerpo actúa como un antagonista. Algunos ejemplos son el receptor de insulina (Kahn et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1978) 75:4209-13) , el receptor de EGF (Schreiber et al., J Biol Chem. (1983) 258:846-53) , el receptor de EPO (Schneider et al., Blood (1997) 89:473-82) , el receptor de GH (Wan et al., Mol Endocrinol. (2003) 17:2240-50) o el receptor beta 2-adrenérgico (Mijares et al., Mol Pharmacol. (2000) 58:373-9) .

Sin embargo, los constructos con este tipo de propiedades monovalentes, p. ej., fragmentos Fab, pueden ser desfavorables, debido a otras propiedades, tales como una semivida in vivo corta. Por lo tanto, sería sumamente conveniente combinar una interacción antígeno-anticuerpo monovalente con las propiedades de una inmunoglobulina completa que comprende el dominio Fc. En la presente invención se proporcionan moléculas de este tipo.

Compendio de la invención Es un objeto de la presente invención proporcionar una inmunoglobulina que comprende al menos dos dominios variables, donde un dominio variable incluye la región completa de unión al antígeno de una rama de la molécula de inmunoglobulina, donde un dominio variable se une a una molécula diana, y donde al menos otro dominio variable comprende un marcador de purificación, donde el dominio variable que comprende el marcador de purificación no se une a la molécula diana, y donde dicho marcador de purificación está comprendido en la región CDR del otro dominio variable mencionado y se selecciona entre un marcador de histidina, un marcador de hexahistidina, un marcador Strep, un marcador myc, un marcador Flag y un marcador V5, o una variante sustancialmente idéntica de estos la cual retiene la propiedad del marcador de purificación de unirse específicamente a un resto que reconoce de manera específica el marcador de purificación y donde la inmunoglobulina es monovalente respecto a la unión de la molécula diana pero retiene las propiedades de una inmunoglobulina completa en lo que respecta al tamaño y presencia del dominio Fc.

En una realización, dicho marcador de purificación está comprendido en la H-CDR3 o en la H-CDR2.

En otra realización, dicho marcador de purificación está comprendido en la L-CDR2.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que comprende al menos dos dominios variables, donde un dominio variable incluye la región completa de unión al antígeno de una rama de la molécula de inmunoglobulina, donde un dominio variable se une a una molécula diana, y donde al menos otro dominio variable comprende un marcador de purificación.

En otra realización, la presente invención proporciona un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico.

En otra realización, la presente invención proporciona una célula que comprende dicho vector. En una realización adicional dicha célula es una célula de mamíferos.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina de la presente invención.

En una realización dicha inmunoglobulina se utiliza en el diagnóstico de una enfermedad o trastorno.

En una realización dicha inmunoglobulina se utiliza en el tratamiento de una enfermedad o trastorno.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para purificar dicha inmunoglobulina, que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una solución que comprende una inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, (b) poner en contacto la solución del paso (a) con un resto con afinidad por el marcador de purificación de dicha inmunoglobulina, (c) permitir la unión de la inmunoglobulina a dicho resto, (d) eliminar todos o sustancialmente todos los componentes de la solución que no se unen al resto y (e) recuperar la inmunoglobulina a partir del resto.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la purificación de las moléculas de unión proteináceas de la presente invención mediante cromatografía con Ni-NTA.

El eje x es el eje temporal. El eje y indica la concentración del ingrediente utilizado para eluir el material de la columna (en el presente caso imidazol) . Los “círculos negros” indican que el respectivo VH o VL no comprende un marcador de purificación. Cuando se combina un VH de este tipo con un VL que tampoco comprende un marcador de purificación, la rama respectiva es específica respecto a una molécula diana. Los “círculos blancos” indican que al menos un CDR del respectivo VH o VL comprende un marcador de purificación. Las tres especies de inmunoglobulinas diferentes eluyen en fracciones diferentes con un gradiente de imidazol. La especie de inmunoglobulina sin un marcador de purificación se detecta en el flujo a lo largo de las fracciones, y las especie de inmunoglobulina que comprende un marcador de purificación en una rama de la molécula se eluye antes en comparación con la especie de inmunoglobulina que comprende un marcador de purificación en ambas ramas de la molécula.

La Figura 2 muestra la especificidad de unión de cuatros fragmentos Fab analizada mediante ELISA. Se recubrió con la lisozima de huevo de gallina o CD38-Fc (5 µg/mL) una placa de ELISA Maxisorp (Nunc) . Se añadieron los fragmentos Fab y después del lavado se detectaron los fragmentos Fab unidos específicamente mediante incubación con AP conjugada con anticuerpos específicos contra la (Fab) 2 de la IgG humana y a continuación mediante desarrollo con el sustrato Atto-Phos soluble (Roche) diluido en agua. Las medidas de fluorescencia se realizaron en un lector de placas Tecan a una emisión de 535 nm. Los Fab estudiados fueron MOR03207 (específico respecto a la lisozima de huevo de gallina) , MOR03080 (específico respecto a CD38) , MOR08428 (GYSGHHHHHHSGDY reemplazó a H-CDR3 de MOR03207) y MOR08441 (VH de MOR08428 y VL de MOR03080) .

La Figura 3 muestra la unión específica de tres fragmentos Fab analizados mediante FACS utilizando células CHO-K1 que expresan de manera recombinante la CD38 humana. Se añadieron los fragmentos Fab a las células y después del lavado, se detectaron los fragmentos Fab unidos específicamente mediante incubación con PE conjugada con anticuerpos específicos contra la (Fab) 2 de la IgG humana (Jackson Immuno Research) . Se determinó la fluorescencia de la mediana mediante un instrumento FACSArray (Becton Dickinson) . Los Fab estudiados fueron MOR03207 (específico respecto a la lisozima de huevo de gallina) , MOR03080 (específico respecto a CD38) y MOR08441 (VH de MOR08428 y VL... [Seguir leyendo]

1. Una inmunoglobulina que comprende al menos dos dominios variables, donde un dominio variable incluye la región completa de unión al antígeno de una rama de la molécula de inmunoglobulina, donde un dominio variable se une a una molécula diana, y donde al menos otro dominio variable comprende un marcador de purificación, donde el dominio variable que comprende el marcador de purificación no se une a la molécula diana, y donde dicho marcador de purificación está comprendido en la región CDR del otro dominio variable mencionado y se selecciona entre un marcador de histidina, un marcador de hexahistidina, un marcador Strep, un marcador myc, un marcador Flag y un marcador V5, o una variante sustancialmente idéntica de estos la cual retiene la propiedad del marcador de purificación de unirse específicamente a un resto que reconoce de manera específica el marcador de purificación y donde la inmunoglobulina es monovalente respecto a la unión de la molécula diana pero retiene las propiedades de una inmunoglobulina completa en lo que respecta al tamaño y presencia del dominio Fc.

2. La inmunoglobulina de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho marcador de purificación está comprendido en la H-CDR3 o en la H-CDR2.

3. La inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde dicho marcador de purificación está comprendido en la L-CDR2.

4. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

5. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. Una célula que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 5.

7. La célula de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha célula es una célula de mamíferos.

8. Una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un excipiente o portador farmacéuticamente aceptables de esta.

9. Una inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el diagnóstico 25 de una enfermedad o trastorno.

10. Una inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno.

11. Un método para purificar una inmunoglobulina, que comprende los siguientes pasos: (a) proporcionar una solución que comprende una inmunoglobulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, (b)

poner en contacto la solución del paso (a) con un resto con afinidad por el marcador de purificación de dicha inmunoglobulina, (c) permitir la unión de la inmunoglobulina a dicho resto, (d) eliminar todos o sustancialmente todos los componentes de la solución que no se unen al resto y (e) recuperar la inmunoglobulina a partir del resto.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5