Moléculas de unión a antígeno que se unen a EGFR, vectores que los codifican, y usos de los mismos.

Un anticuerpo anti-EGFR humanizado que se une específicamente a EGFR humano,

en el que dicho anticuerpocomprende una región variable de la cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en Id. de Sec. Nº:128, Id. de Sec. Nº:129, Id. de Sec. Nº:131, Id. de Sec. Nº:133, Id. de Sec. Nº:134, Id. de Sec. Nº:136, e Id. de Sec.Nº:138; y una región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en Id. de Sec. Nº:139, Id.de Sec. Nº:140, Id. de Sec. Nº:143, Id. de Sec. Nº:144, Id. de Sec. Nº:145, Id. de Sec. Nº:146, e Id. de Sec. Nº:147,en el que dicho anticuerpo comprende una región Fc y en el que dicho anticuerpo ha sido glicomodificado:

(a) para tener un aumento del porcentaje de oligosacáridos bisectados en la región Fc en comparación con elcorrespondiente anticuerpo no glicomodificado,

(b) para tener un número reducido de residuos de fucosa en la región Fc en comparación con elcorrespondiente anticuerpo no glicomodificado,

(c) para tener un aumento de la afinidad de unión al receptor Fc en comparación con el correspondienteanticuerpo no glicomodificado, y/o~

(d) para tener un aumento de la función efectora en comparación con el correspondiente anticuerpo noglicomodificado, en el que los puntos (a) a (d) resultan de un aumento de actividad ß(1,4)-NacetilglucosaminiltransferasaIII (GnT III) en una célula huésped que expresa un polipéptido que posee dichaactividad.

Moléculas de unión a antígeno que se unen a EGFR, vectores que los codifican, y usos de los mismos Antecedentes de la invención Campo de la Invención La presente invención está relacionada con un anticuerpo humanizado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) , en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en Id. de Sec. Nº: 128, Id. de Sec. Nº:1.29, Id. de Sec. Nº:131, Id. de Sec. Nº:133, Id. de Sec. Nº:134, Id. de Sec. Nº:136, e Id. de Sec. Nº:138, y una región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en Id. de Sec. Nº:139, Id. de Sec. Nº:140, Id. de Sec. Nº:143, Id. de Sec. Nº:144, Id. de Sec. Nº:145, Id. de Sec. Nº:146 e Id. de Sec. Nº:147, en el que dicho anticuerpo comprende una región Fc y en el que dicho anticuerpo ha sido glicomodificado: (i) para tener un porcentaje mayor de oligosacáridos bisectados en la región Fc en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado, (ii) para tener un número reducido de residuos de fucosa en la región Fc en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado, (iii) para tener una afinidad mayor de unión al receptor Fc en comparación con un correspondiente anticuerpo no glicomodificado, y/o (iv) para tener una mayor función efectora en comparación con un correspondiente anticuerpo no glicomodificado, en el que los puntos (i) a (iv) resultan de una actividad aumentada de β (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III) en una célula huésped que expresa un polipéptido que reduce a la mitad dicha actividad.

La descripción en general está relacionada con moléculas de unión a antígeno (ABM) . En realizaciones particulares, la descripción está relacionada con anticuerpos monoclonales recombinantes, incluyendo anticuerpos quiméricos, privatizados o humanizados específicos para el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) . Además, la descripción está relacionada con moléculas de ácido nucleico que codifican dichas ABM, y vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico. La descripción además está relacionada con métodos para producir las ABM descritas en este documento, y composiciones que comprenden estas ABM para utilizar en el tratamiento de una enfermedad. Además, la descripción está relacionada con ABM con glicosilación modificada que tiene propiedades terapéuticas mejoradas, que incluye anticuerpos con aumento de la unión al receptor Fc y aumento de la función efectora.

Antecedentes

EGFR y anticuerpos anti-EGFR

El receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (también conocido como HER-1 o Erb-B1, y referido en este documento como "EGFR") es un receptor transmembrana de 170 kDa codificado por el c protooncogén -erbB, y presenta una actividad tirosina quinasa intrínseca (Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996) ; Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) ) . La entrada de la base de datos SwissProt P00533 proporciona la secuencia de EGFR. Existen también isoformas y variantes de EGFR (por ejemplo, transcritos de RNA alternativos, versiones truncadas, polimorfismos; etc.) que incluyen pero no se limitan a aquellos identificados por los números de entrada de la base de datos SwissProt P00533-1, P00533-2, P00533-3, y P00533-4. EGFR se conoce por unirse a ligandos que incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento transformante-α (TGF-α) , amfiregulina, EGF de unión a heparina (hb-EGF) , betacelulina, y epiregulina (Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) ; Mendelsohn y Haselga, Oncogene 19: 6550-6565 (2000) ) . EGFR regula numerosos procesos celulares mediante las rutas de transducción de señales mediadas por tirosina quinasas, que incluyen, pero no se limitan a, activación de las rutas de transducción de señales que controlan la proliferación celular, diferenciación, supervivencia celular, apoptosis, angiogénesis, mitogénesis, y metástasis (Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003) ; Tsao y Herbst, Signal 4:4-9 (2003) ; Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) ; Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996) ) .

La sobreexpresión de EGFR se ha descrito en muchas enfermedades malignas humanas, que incluye cáncer de vejiga, cerebro, cabeza y cuello, páncreas, pulmón, mama, ovario, colon, próstata, y riñón. (Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003) ; Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228235 (1996) ) . En muchas de estas enfermedades, la sobreexpresión de EGFR se correlaciona o se asocia con un pronóstico pobre de los pacientes. (Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) ; Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996) ) . EGFR también se expresa en las células de tejidos normales, en particular los tejidos epiteliales de la piel, hígado, y tracto gastrointestinal, aunque en niveles generalmente inferiores que en las células malignas (Herbst y Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002) ) .

Los anticuerpos monoclonales no conjugados (mAb) pueden ser medicinas útiles para el tratamiento del cáncer, tal como se demuestra por la aprobación de la U.S. Food and Drug Administration del Trastuzumab (Herceptin™; Genentech Inc, ) para el tratamiento de cáncer de mama avanzado (Grillo-Lopez, A. J., et al. Semin. Oncol. 26:66-73 (1999) ; Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999) ) , Rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego,

CA, y Genentech Inc., San Francisco, CA) , para el tratamiento de linfocitos B CD20 positivos, linfoma no Hodgkin de bajo grado o folicular, Gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Weth-Ayerst) para el tratamiento de la recaída de la leucemia mieloide aguda, y Alemtuzurnab (CAMPATH ™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de linfocitos B. El éxito de estos productos no solo se debe a su eficacia sino también en sus excelentes perfiles de seguridad (Grillo-Lopez, AJ., et al., Semin. Oncol. 26:66-73 (1999) ; Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18 (1999) ) . A pesar de los logros de estos medicamentos, en la actualidad existe un gran interés en obtener mayor actividad de anticuerpo especifico de lo que normalmente proporciona la terapia de un mAb conjugado.

Los resultados de una serie de estudios sugieren que los mecanismos dependientes de receptor de Fc contribuyen sustancialmente a la acción de los anticuerpos citotóxicos contra los tumores e indican que un anticuerpo óptimo contra los tumores se uniría preferentemente a los receptores de activación de Fc y mínimamente a la pareja inhibidora FcγRTTB. (Clynes, R. A., et al., Nature Medicine 6 (4) :443-446 (2000) ; Kalergis, A.M., y Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195 (12) :1653-1659 (junio de 2002) . Por ejemplo, los resultados de por lo menos un estudio sugieren que el polimorfismo en el receptor de FcRIIIa, en particular, se asocia fuertemente con la eficacia de la terapia de anticuerpo (Cartron, G., et al., Blood 99 (3) : 754-757 (febrero de 2002) ) . Este estudio demostró que los pacientes homocigotos para FcRIIIa tienen una mejor respuesta al rituximab que los pacientes heterocigotos. Los autores concluyeron que la superior respuesta se debía a una mejor unión in vivo del anticuerpo a FcγRIII2, lo que resultó en una mejor actividad CCDA contra las células del linfoma. (Cartron, G., et al., Blood 99 (3) :754-757 (febrero de 2002) ) .

Se han descrito varias estrategias para detectar EGFR y bloquear las rutas de señalización del EGFR. Los inhibidores tirosina quinasa de moléculas pequeñas, como gefitinib, erlotinib, y C1-1033 bloquean la autofosforilación de EGFR en la región intracelular tirosina quinasa, inhibiendo con ello los eventos de señalización corriente abajo (Tsao y Herbst, Señal 4: 4-9 (2003) ) . Los anticuerpos monoclonales, por otro lado, se dirigen a la porción extracelular de EGFR, lo que resulta en el bloqueo de la unión del ligando y de este modo inhibe los procesos corriente abajo, tales como la proliferación celular (Tsao y Herbst, Signal 4: 4-9 (2003) ) .

Se han generado varios anticuerpos monoclonales murinos que logran un bloqueo de este tipo in vitro y que han sido evaluados para determinar su capacidad para afectar el crecimiento del tumor en modelos de xenoinjertos de ratón (Masui, et al., Cancer Res. 46: 5592-5598 (1986) ; Masui, et al., Cancer Res. 44:1002-1007 (1984) ; Goldstein, et al., Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318 (1995) ) . Por ejemplo, EMD 55900 (EMD Pharmaceuticals) es un anticuerpo monoclonal anti-EGFR murino que se produjo contra la línea celular A431 de carcinoma epidermoide humano y se puso a prueba en estudios clínicos de pacientes... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-EGFR humanizado que se une específicamente a EGFR humano, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en Id. de Sec. Nº: 128, Id. de Sec. Nº:129, Id. de Sec. Nº:131, Id. de Sec. Nº:133, Id. de Sec. Nº:134, Id. de Sec. Nº:136, e Id. de Sec. Nº:138; y una región variable de cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en Id. de Sec. Nº:139, Id. de Sec. Nº:140, Id. de Sec. Nº:143, Id. de Sec. Nº:144, Id. de Sec. Nº:145, Id. de Sec. Nº:146, e Id. de Sec. Nº:147, en el que dicho anticuerpo comprende una región Fc y en el que dicho anticuerpo ha sido glicomodificado:

(a) para tener un aumento del porcentaje de oligosacáridos bisectados en la región Fc en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado,

(b) para tener un número reducido de residuos de fucosa en la región Fc en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado,

(c) para tener un aumento de la afinidad de unión al receptor Fc en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado, y/o

(d) para tener un aumento de la función efectora en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado, en el que los puntos (a) a (d) resultan de un aumento de actividad β (1, 4) -Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnT III) en una célula huésped que expresa un polipéptido que posee dicha actividad.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que el aumento en la función efectora se selecciona del grupo que consiste en: aumento de la citotoxicidad celular mediada por Fc, aumento de la unión a células NK, aumento de la unión a macrófagos, aumento de la unión a monocitos, aumento de la unión a células polimorfonucleares, aumento de la apoptosis inducida por señalización directa, aumento de la maduración de células dendríticas, y aumento de la primación de células T.

3. Una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada como se ha definido en reivindicación 1 y un polinucleótido que codifica una región variable de cadena ligera como se ha definido en la reivindicación 1, o un vector que comprende dichos polinucleótidos y en el que dicha célula huésped está modificada para expresar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que posee actividad β (1, 4) -Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnT III) .

4. La célula huésped de la reivindicación 3, en el que dicha célula huésped está modificada además para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que posee actividad manosidasa II.

5. La célula huésped de la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido es un polipéptido de fusión que comprende además el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente en Golgi.

6. La célula huésped de la reivindicación 5, en el que dicho dominio de localización Golgi se selecciona del dominio de localización de manosidasa II, β (1, 2) -N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnT I) , manosidasa I, β (1, 2) -Nacetilglucosaminiltransferasa II (GnT II) , y α1-6 fucosiltransferasa central.

7. Un método para producir un anticuerpo que es capaz de competir con el anticuerpo monoclonal ICR62 de rata para unirse al EGFR humano, en el que dicho anticuerpo monoclonal ICR62 de rata comprende una región variable de la cadena pesada de Id. de Sec. Nº:1 y una región variable de cadena ligera de Id. de Sec. Nº:43, dicho método comprende:

(a) cultivar la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 en un medio bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polinucleótido que codifica dicho polipéptido; y

(b) recuperar dicho anticuerpo en el que dicho anticuerpo comprende una región Fc y en el que dicho anticuerpo ha sido glicomodificado

(i) para tener un aumento del porcentaje de oligosacáridos bisectados en la región Fc en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado,

(ii) para tener un número reducido de residuos de fucosa en la región Fc en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado,

(iii) para tener un aumento de la afinidad de unión al receptor Fc en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado, y/o

(iv) para tener un aumento de la función efectora en comparación con el correspondiente anticuerpo no glicomodificado, en el que los puntos (i) a (iv) resultan de un aumento de la actividad β (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III) en una célula huésped que expresa un polipéptido que posee dicha actividad.

8. Un anticuerpo anti-EGFR humanizado que se une específicamente a EGFR humano, en el que dicho anticuerpo está producido mediante el método de la reivindicación 7.

9. Una composición que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 8 y un transportador

farmacéuticamente aceptable.

10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 8 para utilizar en el tratamiento del cáncer.

11. El uso de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 8 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

12. El anticuerpo de la reivindicación 10 o la utilización de la reivindicación 11, en el que dicho cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel,

cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de riñón, y cáncer de cerebro.

Figura 11

Figura 12

Figura 13

Figura 14

Figura 15

Perfil deoligosacáridoEM-MALDI/TOF paraelanticuerpo IgG1anti-EGFR glicomodificado IHHB-KC humanizado 161

Figura 18 Concentraciones en suero de anti-EGFR el día 1 de la administración intravenosa semanal de anti-EGFR en monos cynomolgus macho

Figura 19

Concentraciones en suero de anti-EGFR el día 1 de la administración intravenosa semanal de anti-EGFR en monos cynomolgus hembra

Figura 20

Relación entre las áreas bajo la curva (AUC168) de tiempo-concentración de anti-EGFR en suero y nivel de dosis el día 1 de la administración intravenosa semanal de anti-EGFR en monos cynomolgus Machos Hembras Dosis

Figura 21

Concentración en suero de anti-EGFR durante la administración intravenosa semanal de anti-EGFR en monos cynomolgus macho

Figura 22

Concentraciones en suero de anti-EGFR durante la administración intravenosa semanal de anti-EGFR en monos cynomolgus hembra Figura 24

Figura 25

Figura 26

Unión aFcRacélulas CHO que expresanFcgammaRIIIahumano Figura 27

Cuarto ensayo de CCDA utilizando células diana A-549 (T) . CCDAmedida mediante el método basado en la liberación de LDH.CMSP efectoras ? humanas proporción E:T = 25:1

Figura 28

% muerte específica Cuarto ensayo de CCDA utilizando células diana CYNOM-K1 (T) . CCDA medida mediante el método basado en la liberación de LDH. CMSP efectoras ? humanas proporción E:T = 25:1

Concentración de anticuerpo (ng/ml)

Figura 30

Figura 31Figura 32