Mieloperoxidasa, un indicador de riesgo para enfermedad cardiovascular.

Un procedimiento de diagnóstico para caracterizar el riesgo de un paciente humano de desarrollar opresentar una enfermedad cardiovascular seleccionada entre aterosclerosis,

cardiopatía coronaria, enfermedadcerebrovascular y enfermedad vascular periférica, o un trastorno cardiovascular seleccionado entre infarto demiocardio, ictus, angina de pecho, ataques isquémicos transitorios y insuficiencia cardiaca congestiva, quecomprende:

a) obtener los niveles de actividad de la mieloperoxidasa (MPO), la masa de la mieloperoxidasa (MPO), o ambas enuna muestra corporal de un paciente humano, en el que dicha muestra corporal es sangre, o un derivado de sangreobtenido a partir de dicha sangre seleccionado entre leucocitos, neutrófilos, monocitos, suero y plasma; y

b) comparar los niveles de la actividad de la mieloperoxidasa (MPO), la masa de la mieloperoxidasa (MPO), oambas, respectivamente, en la muestra corporal de un paciente humano con uno o dos valores predeterminados;en el que niveles más altos indican el mayor riesgo del paciente humano de desarrollar o presentar dichaenfermedad cardiovascular o dicho trastorno cardiovascular.

Mieloperoxidasa, un indicador de riesgo para enfermedad cardiovascular.

El trabajo descrito en esta solicitud tuvo el apoyo, al menos en parte, de la Concesión Nº RO1 HDL6252601 del National Institutes of Health. El gobierno de Estados Unidos posee ciertos derechos sobre esta invención.

ANTECEDENTES

La presente invención se refiere al campo de la enfermedad cardiovascular. Más en concreto, se refiere a procedimientos de diagnóstico para determinar si un sujeto individual o de prueba, presenta un riesgo mayor o inferior de desarrollar o presentar enfermedad cardiovascular distinto de otros individuos en una población dada de sujetos humanos.

Enfermedad cardiovascular (ECV) es el término general aplicado a cardiopatías y enfermedades de los vasos sanguíneos, incluyendo aterosclerosis, cardiopatía coronaria, enfermedad cerebrovascular y enfermedad vascular periférica. Los trastornos cardiovasculares son manifestaciones graves de ECV e incluyen infarto de miocardio, ictus, angina de pecho, ataques isquémicos transitorios, insuficiencia cardiaca congestiva. La ECV es responsable de una de cada dos muertes en los Estados Unidos y es la principal enfermedad mortal. Así, la prevención de la enfermedad cardiovascular es un área de gran importancia en la salud pública.

Para prevenir ECV se recomienda una dieta baja en grasas y ejercicio. Además, puede prescribirse una serie de agentes terapéuticos por parte de profesionales médicos a aquellos individuos que, según se sabe, presentan el riesgo de desarrollar o tener ECV. Entre ellos se incluyen agentes de reducción de lípidos que reducen 25 los niveles en sangre de colesterol y triglicéridos. Se usan medicamentos para normalizar la presión arterial en pacientes hipertensos. También pueden prescribirse medicamentos que previenen la activación de plaquetas, tales como aspirina, para pacientes con riesgo de desarrollar ECV. Pueden usarse terapias más agresivas, tal como la administración de múltiples medicamentos, en aquellos individuos que presenten un riesgo elevado. Como las terapias de ECV pueden tener efectos secundarios adversos, es deseable tener pruebas de diagnóstico para identificara aquellos individuos que presenten riesgo, en particular aquellos individuos que presenten un riesgo elevado, de desarrollar o tener ECV.

En la actualidad, se usan varios factores de riesgo entre los profesionales médicos para valorar el riesgo de un individuo de desarrollar ECV y para identificar a individuos que presenten un riesgo elevado. Los principales 35 factores de riesgo de enfermedad cardiovascular incluyen hipertensión, antecedentes familiares de ECV prematura, tabaquismo, altos niveles de colesterol total, bajos niveles de colesterol HDL, obesidad y diabetes. Los principales factores de riesgo de ECV son aditivos, y normalmente se usan en conjunto entre los médicos en un algoritmo de predicción de riesgo para dirigirse a aquellos individuos que tengan la máxima probabilidad de beneficiarse de un tratamiento de ECV. Estos algoritmos consiguen una alta sensibilidad y especificidad para predecir un riesgo del 40 15% de ECV en un plazo de 10 años. Sin embargo, la capacidad de los algoritmos actuales de predecir una mayor probabilidad de desarrollar ECV es limitada. Entre los individuos que no tienen ninguno de los factores de riesgo actuales, el riesgo a 10 años de desarrollar ECV sigue siendo del 2% aproximadamente. Además, se produce un alto número de complicaciones de ECV en individuos con perfiles de riesgo aparentemente bajos o moderados, según se determina usando en la actualidad factores de riesgo conocidos. Así, existe la necesidad de ampliar el

algoritmo actual de riesgo cardiovascular para identificar un espectro más amplio de individuos en riesgo de o afectadas por ECV.

El mecanismo de aterosclerosis no se comprende bien. En la última década una diversidad de datos clínicos, patológicos, bioquímicos y genéticos sustentan la noción de que la aterosclerosis es un trastorno 50 inflamatorio crónico. Los reactivos de fase aguda (por ejemplo, proteína C reactiva, proteínas de complemento) , marcadores sensibles pero inespecíficos de inflamación, están enriquecidos en estrías grasas y las fases tardías de las lesiones ateroscleróticas. En un reciente ensayo clínico prospectivo, los niveles de plasma de base de proteína C reactiva predecían independientemente riesgo de infarto de miocardio e ictus por primera vez en individuos aparentemente sanos. La patente de Estados Unidos Nº 6.040.147 describe procedimientos que usan proteína C

reactiva, citocinas y moléculas de adhesión celular para caracterizar el riesgo de un individuo de desarrollar un trastorno cardiovascular. Aunque útiles, estos marcadores pueden encontrarse en la sangre de individuos con inflamación debido a causas distintas de ECV, y así, estos marcadores pueden no ser suficientemente específicos.

Por consiguiente, aún existe la necesidad de pruebas de diagnóstico adicionales para caracterizar un riesgo en los individuos de desarrollar o de presentar enfermedad cardiovascular. Son especialmente deseables pruebas de diagnóstico que emplean factores de riesgo que son independientes de los factores de riesgo de EAC tradicionales, tales como los niveles de LDL.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona nuevos procedimientos de diagnóstico para caracterizar el riesgo de un individuo de desarrollar o presentar enfermedad cardiovascular. Los presentes procedimientos son especialmente útiles para identificar aquellos individuos que necesitan terapias ECV altamente agresivas, así como aquellos individuos que no requieren terapias dirigidas a prevenir ECV. Marquez y col., 1995, J. Bio. Chem., vol. 270, Nº 51, págs. 30434-30440 describen estudios de la cinética y el mecanismo de la oxidación de tirosina y ditirosina por dos intermedios de mieloperoxidasa (MPO) , representados MPO-I (el producto de oxidación de dos electrones de la MPO) y MPO-II (el producto de reducción de un electrón de la MPO-I) .

Schmitt y col., 1999, Biochemistr y , vol. 38, Nº 51, págs. 16904-16915 describen estudios de intermedios de nitración generados por neutrófilos y MPO como catalizadores fisiológicos para la peroxidación lipídica. Los autores indican que la MPO (o neutrófilos activados de forma artificial) provocan la formación de lípidos oxidados, in vitro, en condiciones fisiológicas, y en presencia de nitrito. Los autores también informan de que el sistema MPO-nitrito puede producir varios productos de peroxidación lipídica, incluyendo algunos citados en las reivindicaciones en trámite.

Abu-Soud y col., 2000, J. Bio. Chem., vol. 275, Nº 8, págs. 5425-5430 describen estudios sobre los efectos del óxido nítrico (NO) sobre la actividad catalítica de la mieloperoxidasa humana aislada (MPO) . Los estudios muestran que el NO de unión a MPO es reversible y se asocia con la modulación bifásica de la actividad catalítica de la peroxidasa clásica (véase la página 5426, columna izquierda, en el mismo) .

El documento EP 0 389 381 (Sanofi SA) describe un kit para ensayar las enzimas celulares endógenas (y especialmente la mieloperoxidasa) que son características de una población o subpoblación celular (y especialmente los granulocitos) . En resumen, las células se inmovilizan en primer lugar sobre un soporte sólido mediante inmunocaptura, y después las células capturadas se tratan con un sustrato enzimático adecuado. La inmunocaptura se consigue mediante la unión entre uno o más antígenos superficiales de las células, y uno o más anticuerpos monoclonales correspondientes específicos para el antígeno o los antígenos.

Mertens y col., 2001, FASEB J., vol. 15, Nº 5, págs. 2073-2084 se refiere a estudios de la función de LDL y HDL oxidadas en enfermedad cardiovascular. Los autores analizan estudios anteriores que se refieren a MPO y 35 productos de oxidación generados por MPO encontrados en lesiones. Los autores también describen sus propios estudios recientes que se refieren a la circulación de LDL oxidada, en los que presentan el anticuerpo monoclonal contra una forma oxidada de la molécula apoB-100, específicamente, apoB-100 sustituida con aldehído, y el uso del este anticuerpo en ensayos para determinar los niveles de LDL oxidada de circulación. Podrez y col., 2000, J. Clin. Invest., vol. 105, Nº 8, págs. 1095-1108 describen estudios que se refieren al sistema MPO-H2O2-NO2-, la función de este sistema en la oxidación de LDL. El estudio identifica los receptores que reconocen las formas de alta captación de LDL nitrada y oxidada mediante macrófagos.

Hong y col., 2002, Hypertension, vol. 38, págs. 1044-1048 describen estudios que se refieren a la... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de diagnóstico para caracterizar el riesgo de un paciente humano de desarrollar o presentar una enfermedad cardiovascular seleccionada entre aterosclerosis, cardiopatía coronaria, enfermedad

cerebrovascular y enfermedad vascular periférica, o un trastorno cardiovascular seleccionado entre infarto de miocardio, ictus, angina de pecho, ataques isquémicos transitorios y insuficiencia cardiaca congestiva, que comprende:

a) obtener los niveles de actividad de la mieloperoxidasa (MPO) , la masa de la mieloperoxidasa (MPO) , o ambas en una muestra corporal de un paciente humano, en el que dicha muestra corporal es sangre, o un derivado de sangre obtenido a partir de dicha sangre seleccionado entre leucocitos, neutrófilos, monocitos, suero y plasma; y

b) comparar los niveles de la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) , la masa de la mieloperoxidasa (MPO) , o ambas, respectivamente, en la muestra corporal de un paciente humano con uno o dos valores predeterminados;

en el que niveles más altos indican el mayor riesgo del paciente humano de desarrollar o presentar dicha enfermedad cardiovascular o dicho trastorno cardiovascular.

2. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el nivel de actividad de 20 la mieloperoxidasa en la muestra corporal de un paciente humano se obtiene mediante citometría de flujo.

3. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que uno de dicho uno o dos valores predeterminados es un único valor normalizado o un intervalo de valores normalizados, y se basa en los niveles de actividad de la MPO en muestras corporales comparables de la población general o una población seleccionada de sujetos humanos.

4. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que uno de dicho uno o dos valores predeterminados es un único valor representativo o un intervalo de valores representativos, y se basa en los niveles de actividad de la MPO en muestras corporales comparables de la población general o una población seleccionada de sujetos humanos.

5. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que uno de dicho uno o dos valores predeterminados es una pluralidad de intervalos de niveles de la actividad de la MPO predeterminados que se basan en los niveles de actividad de la MPO en muestras corporales comparables de la población general o una población seleccionada de sujetos humanos, y dicha etapa de comparación comprende determinar en cuál de dicha pluralidad de intervalos de niveles de la actividad de la MPO predeterminados se sitúa el nivel de actividad de la MPO de un paciente humano.

6. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el

que los niveles de masa de la MPO en la muestra corporal de un paciente humano se obtienen mediante una técnica inmunológica.

7. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que uno de dicho uno o dos valores predeterminados es un único valor normalizado o un intervalo de valores 45 normalizados, y se basa en los niveles de masa de la MPO en muestras corporales comparables de la población general o una población seleccionada de sujetos humanos.

8. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que uno de dicho uno o dos valores predeterminados es un único valor representativo o un intervalo de valores 50 representativos, y se basa en los niveles de masa de la MPO en muestras corporales comparables de la población general o una población seleccionada de sujetos humanos.

9. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que uno de dicho uno o dos valores predeterminados es una pluralidad de intervalos de niveles de masa de la MPO

predeterminados que se basan en los niveles de masa de la MPO en muestras corporales comparables de la población general o una población seleccionada de sujetos humanos, y dicha etapa de comparación comprende determinar en cuál de dicha pluralidad de intervalos de niveles de masa de la MPO predeterminados se sitúa el nivel de masa de la MPO de un paciente humano.

10. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha muestra corporal es plasma.

11. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el 5 que dicha muestra corporal es suero.

12. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha muestra corporal son neutrófilos obtenidos de dicha sangre.

13. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha muestra corporal son monocitos obtenidos de dicha sangre.

14. Un procedimiento de diagnóstico para caracterizar el riesgo de un paciente humano de desarrollar o presentar una enfermedad cardiovascular seleccionada entre aterosclerosis, cardiopatía coronaria, enfermedad

cerebrovascular y enfermedad vascular periférica, o un trastorno cardiovascular seleccionado entre infarto de miocardio, ictus, angina de pecho, ataques isquémicos transitorios e insuficiencia cardiaca congestiva, que comprende:

a) obtener los niveles de uno o más productos de oxidación generados por mieloperoxidasa seleccionados en una 20 muestra corporal de un paciente humano,

en el que dicha muestra corporal es orina, sangre o un derivado de sangre seleccionado entre leucocitos, neutrófilos, monocitos, suero y plasma,

en el que cada uno de dicho uno o más productos de oxidación generados por mieloperoxidasa seleccionados se selecciona entre nitrotirosina, ditirosina y sulfóxido de metionina; y

b) comparar los niveles de cada uno de dicho uno o más productos de oxidación generados por mieloperoxidasa seleccionados en la muestra corporal de un paciente humano con un valor predeterminado;

en el que niveles más altos indican el mayor riesgo del paciente humano de desarrollar o presentar dicha enfermedad cardiovascular o dicho trastorno cardiovascular.

15. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 14, en el que uno de dicho uno o 35 más productos de oxidación generados por mieloperoxidasa seleccionados es ditirosina, nitrotirosina.

16. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 14, en el que uno de dicho uno o más productos de oxidación generados por mieloperoxidasa seleccionados es nitrotirosina.

17. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el valor predeterminado es un único valor representativo o un intervalo de valores representativos, y se basa en los niveles de dicho producto de oxidación de mieloperoxidasa seleccionado en muestras corporales comparables de la población general o una población seleccionada de sujetos humanos.

18. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el valor predeterminado es una pluralidad de intervalos de niveles de la actividad de la MPO predeterminados que se basan en los niveles de dicho producto de oxidación de mieloperoxidasa seleccionado en muestras corporales comparables de la población general o una población seleccionada de sujetos humanos, y dicha etapa de comparación comprende determinar en cuál de dicha pluralidad de intervalos de producto de oxidación generado por

mieloperoxidasa seleccionados predeterminados se sitúa el nivel del producto de oxidación generado por mieloperoxidasa seleccionado de un paciente humano.

19. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el

que dicha muestra corporal es plasma. 55

20. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que dicha muestra corporal es suero.

21. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el

que dicha muestra corporal son neutrófilos.

22. Un procedimiento de diagnóstico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el

que dicha muestra corporal son monocitos. 5

23. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

c) obtener los niveles de un producto de oxidación generado por mieloperoxidasa seleccionado en dicha muestra corporal,

en el que dicho producto de oxidación generado por mieloperoxidasa seleccionado se selecciona entre nitrotirosina libre, nitrotirosina unida a péptido, ditirosina libre, ditirosina unida a péptido, sulfóxido de metionina libre, sulfóxido de metionina unido a péptido y un producto de peroxidación lipídica generado por MPO seleccionado entre ácidos hidroxi-eicosatetraenoicos (HETE) ; ácidos hidroxi-octadecadienoicos (HODE) , F2Isoprostanos; los monoésteres glutáricos y nonanodioicos de 2-lisoPC (G-PC y ND-PC, respectivamente) ; el ácido 9-hidroxi-10-dodecenedioico y ésteres del ácido 5-hidroxi-8-oxo-6-octenedioico de 2-lisoPC (HDdiA-PC y BOdiA-PC, respectivamente) ; el ácido 9hidroxi-12-oxo-10-dodecenoico y ésteres del ácido 5-hidroxi-8-oxo-6-octenoico de 2-lisoPC (HODA-PC y HOOA-PC, respectivamente) ; el ácido 9-ceto-12-oxo-10-dodecenoico y ésteres del ácido 5-ceto-8-oxo-6-octenoico de 2-lisoPC (KODA-PC y KOOA-PC, respectivamente) ; el ácido 9-ceto-10-dodecendioico y ésteres del ácido 5-ceto-6

octendioico de 2-lisoPC (KDdiA-PC y KOdiA-PC, respectivamente) ; el ácido 5-oxovalerico y ésteres del ácido 9ºxononanoico de 2-lisoPC (OV-PC y ON-PC, respectivamente) ; 5-colesten-5α, 6α-epoxi-3β-ol (colesterol α-epóxido) ; 5-colesten-5β-6β-epoxi-3β-ol (colesterol β-epóxido) ; 5-colesten-3β, 7β-diol (7-OH-colesterol) ; 5-colesten-3β, 25-diol (25-OH colesterol) ; 5-colesten-3β-ol-7β-hidroperóxido (7-OOH colesterol) ; y colestan-3β, 5α, 6β-triol (triol) ; y

d) comparar el nivel de dicho producto de oxidación generado por mieloperoxidasa seleccionado en la muestra corporal con un valor predeterminado adicional;

en el que niveles elevados de la etapa b y la etapa d indican el mayor riesgo de un paciente humano de desarrollar o presentar dicha enfermedad cardiovascular o dicho trastorno cardiovascular.

24. Un procedimiento para evaluar un agente terapéutico para una enfermedad cardiovascular seleccionada entre aterosclerosis, cardiopatía coronaria, enfermedad cerebrovascular y enfermedad vascular periférica, o un trastorno cardiovascular seleccionado entre infarto de miocardio, ictus, angina de pecho, ataques isquémicos transitorios e insuficiencia cardiaca congestiva, en un sujeto que se sospecha que tiene, o que tiene,

dicha enfermedad cardiovascular o dicho trastorno cardiovascular, que comprende:

comparar los niveles de uno o más productos de oxidación generados por mieloperoxidasa (MPO) seleccionados en una muestra corporal tomada del sujeto después del tratamiento con dicho agente terapéutico con los niveles de uno o más productos de oxidación generados por mieloperoxidasa (MPO) seleccionados en una muestra corporal 40 correspondiente tomada del sujeto antes del tratamiento con dicho agente terapéutico,

en el que dicha muestra corporal es sangre, un derivado de sangre seleccionado entre leucocitos, neutrófilos, monocitos, suero y plasma, u orina, y

en el que dicho uno o más productos de oxidación generados por MPO seleccionados se seleccionan entre ditirosina libre, ditirosina unida a péptido, nitrotirosina libre o nitrotirosina unida a péptido, sulfóxido de metionina libre y sulfóxido de metionina unido a péptido.

25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, que comprende adicionalmente la etapa de 50 comparar los niveles de un segundo predictor de riesgo en la muestra de sangre tomada del sujeto después del tratamiento con dicho agente terapéutico con niveles de dicho segundo factor de riesgo en una muestra corporal correspondiente tomada del sujeto antes del tratamiento, en el que el segundo predictor de riesgo se selecciona entre LDL, proteína C reactiva, colesterol total, colesterol HDL, triglicéridos, relación LDL/HDL, Lp (a) , Interleucina 6, un producto de peroxidación lipídica generado por MPO y

homocisteína.

26. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicho producto de peroxidación lipídica generado por MPO se selecciona entre HETE, HODE y F2lsoprostanos.

27. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho producto de peroxidación lipídica generado por MPO se selecciona entre G-PC, ND-PC, HDdiA-PC, HOdiA-PC, HODA-PC, HOOA-PC, KODA-PC, KOOA-PC, KDdiA-PC, KOdiA-PC, OV-PC y ON-PC.