Método y aparato para determinar los índices de células sanguíneas rojas en una muestra de sangre utilizando la pigmentación intrínseca de la hemoglobina contenida en células sanguíneas rojas.

Un método para determinar la concentración de hemoglobina de las células sanguíneas rojas de una muestra desangre que comprende las etapas de:

depositar la muestra en una cámara de análisis (10) adaptada para contener en forma quiescente la muestra parasu análisis, estando la cámara (10) definida por una superficie interior (14) de un primer panel (12), y unasuperficie interior (18) de un segundo panel (16), en la que ambos paneles (12, 16) son transparentes, y la cámara(10) tiene una altura (20) conocida o determinable que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de lospaneles (12, 16), caracterizada porque dicha altura (20) es tal que al menos una célula sanguínea roja dentro dela muestra está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18);

captar imágenes de al menos una célula sanguínea roja que está en contacto con las superficies interiores(14,18);

determinar un valor de densidad óptica de al menos una parte de la célula sanguínea roja de la que se hancaptado las imágenes en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) y

determinar la concentración de hemoglobina de la célula sanguínea roja en contacto con las superficies interiores(14, 18), usando la densidad óptica determinada.

Método y aparato para determinar los índices de células sanguíneas rojas en una muestra de sangre utilizando la pigmentación intrínseca de la hemoglobina contenida en las células sanguíneas rojas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo técnico La presente invención se refiere aparatos y métodos para el análisis de muestras de sangre en general, y para la determinación del volumen de una célula sanguínea roja así como del volumen medio de células de una muestra en particular.

2. Información de los antecedentes Médicos, veterinarios y científicos han examinado fluidos biológicos de humanos y animales, especialmente sangre, para determinar sus cantidades de partículas constituyentes así como para identificar la presencia de partículas inusuales no vistas en sujetos saludables. Las partículas generalmente medidas, cuantificadas e identificadas incluyen células sanguíneas rojas (RBC) , células sanguíneas blancas (WBC) y plaquetas. Los análisis de RBC pueden incluir determinaciones del número, tamaño volumen, forma, contenido y concentración de hemoglobina de RBC, y el hematocrito (también denominado el volumen relleno de células) . Los análisis de RBC pueden implicar también la determinación de la presencia y/o concentración de ciertos componentes dentro de las células sanguíneas rojas tales como ADN, ARN, incluyendo la detección de la presencia y/o enumeración de hematoparásitos (por ejemplo parásitos de la malaria) o bien en las RBC o tripanosomas que son extracelulares u organismos de leismaniasis que están en las WBC así como muchos otros hematoparásitos. Los análisis de WBC pueden incluir una determinación de la frecuencia de población de subtipos de WBC denominado generalmente un recuento de WBC diferencial, así como la notificación de cualquier tipo de célula inusual no encontrada en individuos saludables. Los análisis de plaquetas (o en cientos animales que incluyen pájaros, reptiles y peces, trombocitos que tienen una función similar a la de las plaquetas en los mamíferos pero que son aproximadamente diez veces más grandes y están nucleados) pueden incluir el número, tamaño, forma, textura de las plaquetas y determinaciones volumétricas, incluyendo la determinación de la presencia de aglomeraciones de plaquetas o trombocitos dentro de la muestra.

Las técnicas de examen de sangre conocidas, descritas con detalle en textos médicos tales como Wintrobe’s Clinical Hematology 12ª Edición, generalmente dividen los métodos de examen en métodos de tipo manuales, de centrifugado y de impedancia. Los métodos manuales para la enumeración de células implican típicamente la creación de un volumen determinado con exactitud de una muestra de sangre o fluido que está cuantitativamente diluida y recontada visualmente en una cámara de recuento. Los métodos de examen manual incluyen examinar un frotis periférico en el que se determinan las cantidades relativas de los tipos de partículas mediante inspección visual. Los métodos de examen de centrifugado incluyen el centrifugado de la muestra, causando la separación de la muestra en capas de constituyentes según las densidades relativas de dichos constituyentes. Se puede teñir cada capa de componente para mejorar la visibilidad o detección. Los métodos de impedancia implican el examen de un volumen exacto de sangre que se trata según las partículas que se van a medir, por ejemplo, lisando RBC para la enumeración de las células nucleadas y diluyendo volumétricamente la muestra en un fluido conductor. El procedimiento implica típicamente monitorizar una corriente o voltaje aplicado a la muestra que pasa a través de un paso estrecho para determinar el efecto que las partículas tienen sobre la corriente/voltaje a medida que las partículas pasan a través en una única fila. Otras técnicas implican analizar la intensidad y ángulo de dispersión de luz incidente para las partículas que pasan en una única fila a través de un haz de luz. Se pueden usar también métodos citométricos de flujo que implican teñir las partículas de interés en suspensión con fluoróforos, unidos a anticuerpos dirigidos contra epítopos superficiales presentes en células o tipos de partículas, excitar las partículas teñidas con luz de longitudes de onda apropiadas, y analizar la emisión de las partículas/células individuales.

Todos los métodos mencionados anteriormente, aparte del frotis periférico o la separación centrífuga, requieren dispensar un volumen exacto de muestra. Las imprecisiones en el volumen de muestra darán lugar a errores cuantitativos de la misma magnitud en el análisis asociado. Con excepción de los métodos de centrifugado, todos los métodos mencionados anteriormente requieren también que la muestra se mezcle con un o más reactivos o diluyentes líquidos, y también requieren la calibración del instrumento para obtener resultados exactos. En el caso de los frotis periféricos, se necesita un alto grado de capacitación para examinar apropiadamente el frotis. Varios de los métodos anteriormente mencionados generan grandes volúmenes de residuos contaminados que resultan caros de manejar. Además, los métodos descritos anteriormente no son adecuados para determinar el recuento de sangre completo (CBC) en pájaros, reptiles y peces en los que las células sanguíneas rojas y trombocitos están nucleados y ciertos mamíferos en los que el tamaño de las células sanguíneas rojas es muy pequeño y se puede confundir con las plaquetas.

La cantidad de información que se puede determinar examinando la sangre de un humano o de un animal es enorme. Es particularmente útil para determinar los índices de RBS, por ejemplo, tamaño de células individuales, contenido y concentración de hemoglobina en células individuales y estadísticas de población de RBC dentro de una muestra. Los valores estadísticos medios y de dispersión (por ejemplo coeficientes de variación) para cada uno de los parámetros anteriormente mencionados pueden proporcionar una importante información, como resulta evidente de su discusión dentro de el texto anteriormente referenciado de Wintrobe, el cual ha permitido a los médicos catalogar mejor los trastornos de RBC.

El documento WO-99/44593 describe el análisis de muestras de sangre entera anticoagulada quiescentes.

Sumario de la invención Según la presente invención, se proporciona un método para determinar los índices de RBC que incluyen el volumen y el contenido y concentración de hemoglobina para RBC individuales, así como los valores estadísticos de población de RBC, incluyendo el número total de RBC presentes en la muestra, y los valores medios para cada uno de los índices anteriormente mencionados dentro de una muestra de sangre sustancialmente no diluida.

Según un primer amplio aspecto de la presente invención, se proporciona un método según la reivindicación 1. La muestra de sangre puede ser una muestra de sangre sustancialmente no diluida. En este método se puede determinar la concentración de hemoglobina de la célula sanguínea roja en contacto con las superficies interiores usando el valor de densidad óptica determinado que es el del píxel ópticamente alineado con la parte de la célula sanguínea roja que se extiende entre las superficies interiores.

Se describe un método para determinar un volumen de célula de una célula sanguínea roja dentro de una muestra de sangre sustancialmente no diluida. El método incluye las etapas de: 1) proporcionar una muestra de sangre sustancialmente no diluida; 2) depositar la muestra en una cámara de análisis adaptada para soportar de forma quiescente la muestra para el análisis, estando la cámara definida por una superficie interior de un primer panel, y una superficie interior de un segundo panel, en la que ambos paneles son transparentes, y la cámara tiene una altura que se extiende entre las superficies interiores de los paneles, y dicha altura es tal que al menos una célula sanguínea roja dentro de la muestra está en contacto con ambas superficies interiores; 3) captar imágenes de al menos una célula sanguínea roja en contacto con las superficies interiores, incluyendo una parte de la célula sanguínea roja en contacto con ambas superficies interiores; 4) determinar la densidad óptica media de la parte de la célula sanguínea roja en contacto con amabas superficies interiores; 5) determinar la densidad óptica total de la célula sanguínea roja entera; y 6) determinar el volumen de célula de al menos una célula sanguínea roja usando la altura de la cámara, la densidad óptica media determinada para la parte de la célula sanguínea roja de la que se han captado imágenes en contacto con ambas superficies interiores, y la densidad óptica determinada para toda la célula sanguínea... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar la concentración de hemoglobina de las células sanguíneas rojas de una muestra de sangre que comprende las etapas de:

depositar la muestra en una cámara de análisis (10) adaptada para contener en forma quiescente la muestra para su análisis, estando la cámara (10) definida por una superficie interior (14) de un primer panel (12) , y una superficie interior (18) de un segundo panel (16) , en la que ambos paneles (12, 16) son transparentes, y la cámara (10) tiene una altura (20) conocida o determinable que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) , caracterizada porque dicha altura (20) es tal que al menos una célula sanguínea roja dentro de la muestra está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ;

captar imágenes de al menos una célula sanguínea roja que está en contacto con las superficies interiores (14, 18) ;

determinar un valor de densidad óptica de al menos una parte de la célula sanguínea roja de la que se han captado las imágenes en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) y

determinar la concentración de hemoglobina de la célula sanguínea roja en contacto con las superficies interiores (14, 18) , usando la densidad óptica determinada.

2. El método de la reivindicación 1, el que la densidad óptica se determina con un criterio por unidad de imagen.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de determinar la concentración de hemoglobina de una pluralidad de células sanguíneas rojas en contacto con las superficies interiores (14, 18) ; y

determinar una concentración media de hemoglobina usando las concentraciones de hemoglobina determinadas para cada una de la pluralidad de células sanguíneas rojas.

4. El método de la reivindicación 3, en el que se obtienen imágenes de toda la muestra.

5. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de mezclar un agente de formación de esferas isovolumétricas con al menos una parte de la muestra.

6. El método de la reivindicación 5, en el que las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) son sustancialmente paralelas, y la altura de la cámara (20) se conoce antes de la determinación de la concentración de hemoglobina.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la altura de la cámara (20) está dentro del intervalo de aproximadamente dos micrómetros a seis micrómetros.

8. El método de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:

captar imágenes de una pluralidad de células sanguíneas rojas, estando al menos una parte de cada célula sanguínea roja en contacto con las superficies interiores (14, 18) ;

determinar un valor de densidad óptica de la parte de cada célula sanguínea roja que está en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ;

determinar un valor medio de la densidad óptica máxima usando las densidades ópticas determinadas para al menos algunas de la pluralidad de células sanguíneas rojas; y

determinar la concentración de hemoglobina de una o más células sanguíneas rojas dentro de la muestra que no están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) , usando el valor medio de densidad óptica máxima determinado.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra tiene una primera parte mezclada con un agente de formación de esferas isovolumétricas y una segunda parte libre de dicho agente de formación de esferas isovolumétricas.

10. El método de la reivindicación 9, en el que al menos algunas de una o más células sanguíneas rojas que no están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) se encuentran dentro de la segunda parte de la muestra, y que comprende además la etapa de determinar una morfología no alterada de algunas de las células sanguíneas rojas dentro de la segunda parte que no están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) .

11. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de mezclar un colorante supravital con la muestra, siendo dicho colorante operable para hacer que la reticulina dentro de los reticulocitos en la muestra emita radiación fluorescente cuando es excitada por luz de una o más longitudes de onda determinadas.

12. El método de la reivindicación 11, que comprende además la etapa de determinar una cantidad relativa de reticulina dentro de uno o más reticulocitos fluorescentes o bien como el área del pico de fluorescencia o como la intensidad del pico de fluorescencia.

13. El método de la reivindicación 11, que comprende además las etapas de: captar imágenes de una pluralidad de células sanguíneas rojas, estando al menos una parte de cada célula sanguínea roja en contacto con las superficies interiores (14, 18) , en el que la imagen se obtiene usando luz de una o más longitudes de onda determinadas que es absorbida por la hemoglobina dispuesta dentro de las células sanguíneas rojas;

captar imágenes de la pluralidad de células sanguíneas rojas a las longitudes de onda predeterminadas operables para hacer que la reticulina dentro de los reticulocitos emita radiación fluorescente;

determinar un valor de densidad óptica de la parte de cada una de dichas células sanguíneas rojas en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) ;

determinar la concentración de hemoglobina de cada una de la pluralidad de células sanguíneas rojas, excluyendo aquellas células sanguíneas rojas que emiten fluorescencia, usando el valor de densidad óptica determinado; y

determinar una concentración media de hemoglobina usando las concentraciones de hemoglobina determinadas para cada una de la pluralidad de células sanguíneas rojas, excluyendo aquellas células sanguíneas rojas que emiten radicación fluorescente.

14. El método de la reivindicación 1, en que la etapa de captar imágenes se realiza a uno o más longitudes de onda predeterminadas, y la determinación de la concentración de hemoglobina utiliza un coeficiente de extinción molar de hemoglobina para una o más de las longitudes de onda predeterminadas.

15. El método de la reivindicación 14, en el que la etapa de captar imágenes se realiza usando un dispositivo analítico calibrado para determinar un valor de coeficiente de extinción molar de hemoglobina calibrado para dicho dispositivo analítico.

FIG. 10

FIG. 11

Depositar una muestra de sangre en la cámara de análisis Determinar la densidad óptica media de una parte de la célula sanguínea roja en contacto con los paneles y la densidad óptica total de la célula sanguínea roja.

Determinar el volumen de la célula sanguínea roja usando la densidad óptica media de la parte de la célula en contacto con los paneles, la densidad óptica total, y la altura de la cámara.

FIG. 12

Determinar el contenido de hemoglobina para una célula sanguínea roja integrando la concentración de hemoglobina determinada en el volumen determinado de la célula sanguínea roja Determinar el contenido medio de hemoglobina determinando el contenido de hemoglobina para una población de células sanguíneas rojas individuales y determinar el valor medio a partir de los valores individuales del contenido de hemoglobina.