Método para determinar la respuesta del cáncer a tratamientos dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico.

Un método para determinar la probabilidad de efectividad de un inhibidor de tirosina quinasa del EGFR para tratarcáncer en un paciente afectado con cáncer,

que comprende: determinar si el gen erbB1 obtenido a partir de unamuestra biológica obtenida de dicho paciente comprende al menos una variación de ácido nucleico, seleccionadode:

a. una mutación en el exón 18 que resulta en una sustitución de cisteína por glicina en la posición 719 de la SEQ IDNO: 763 (G719C) o en una sustitución de serina por glicina en la posición 719 de la SEQ ID NO: 763 (G719S);

b. una supresión en el marco en el exón 19 que resulta en una supresión de al menos los aminoácidos leucina,arginina, ácido glutámico y alanina en los codones 747, 748, 749, y 750 de la SEQ ID NO: 763; o

c. una mutación en el exón 21 que resulta en una sustitución de aminoácido de arginina por leucina en la posición858 de la SEQ ID NO: 763 (L858R) o de glutamina por leucina en la posición 861 de la SEQ ID NO: 763 (L861Q);

en donde la muestra biológica es una muestra de tejido o de fluido aislada del paciente y en donde la presencia de almenos una variación de ácido nucleico indica que el inhibidor de tirosina quinasa del EGFR es probable que seaefectivo; y en donde el cáncer se selecciona de cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncerde mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC),cáncer del sistema nervioso, cáncer de riñón, cáncer de retina, cáncer de piel, cáncer de hígado, cáncer depáncreas, cáncer genitourinario y cáncer de vejiga

Método para determinar la respuesta del cáncer a tratamientos dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico.

Antecedentes Los cánceres de células epiteliales, por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer del bazo, cáncer testicular, cáncer del timo, etc., son enfermedades caracterizadas por el crecimiento acelerado anormal de las células epiteliales. Este crecimiento acelerado causa inicialmente que se forme un tumor. Eventualmente, también se puede producir metástasis a diferentes órganos. Aunque se han logrado avances en el diagnóstico y el tratamiento de diferentes tipos de cáncer, estas enfermedades siguen provocando una mortalidad significativa.

El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en los países industrializados. Los cánceres que comienzan en los pulmones se dividen en dos tipos principales, el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el cáncer de pulmón de células pequeñas, dependiendo de cómo lucen las células bajo un microscopio. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes) generalmente se propaga a otros órganos más lentamente de lo que lo hace el cáncer de pulmón de células pequeñas. Alrededor del 75 por ciento de los casos de cáncer de pulmón se clasifican como cáncer de pulmón de células no pequeñas (por ejemplo, los adenocarcinomas) , y el otro 25 por ciento son cáncer de pulmón de células pequeñas. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos, Japón y Europa Occidental. Para los pacientes con enfermedad avanzada, la quimioterapia proporciona un modesto beneficio para la supervivencia, pero a costa de una toxicidad significativa, lo que subraya la necesidad de agentes terapéuticos que estén específicamente dirigidos a las lesiones genéticas críticas que dirigen el crecimiento del tumor (Schiller J. H. et al., N Engl J Med, 346: 92 - 98, 2002) .

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una proteína enlazada a la membrana de 170 kilodaltons (kDa) , expresada en la superficie de las células epiteliales. EGFR es un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento de proteínas tirosina quinasas, una clase de moléculas reguladoras del ciclo celular. (W. J. Gullick et al, 1986, Cancer Res., 46: 285 - 292) . EGFR se activa cuando su ligando (ya sea EGF o TGF-a) se enlaza al dominio extracelular, lo que resulta en la autofosforilación del dominio intracelular de la tirosina quinasa del receptor (S. Cohen et al., 1980, J. Biol., Chem., 255: 4834 - 4842; A. B. Schreiber et al., 1983, J. Biol., Chem., 258: 846 - 853) .

EGFR es el producto proteico de un oncogén que promueve el crecimiento, erbB o ErbB1, que no es más que uno de los miembros de una familia, es decir, la familia ERBB de protooncogenes, que se cree que desempeñan un papel fundamental en el desarrollo y la progresión de muchos cánceres humanos. En particular, se ha observado un aumento de expresión de EGFR en cáncer de mama, vejiga, pulmón, cabeza, cuello y estómago, así como de glioblastomas. La familia ERBB de oncogenes codifica cuatro receptores transmembrana estructuralmente relacionados, a saber, EGFR, HER-2/neu (erbB2) , HER-3 (erbB3) y HER-4 (erbB4) . Clínicamente, se ha reportado que la amplificación del oncogén ERBB y/o la sobreexpresión del receptor en tumores se correlacionan con la recurrencia de la enfermedad y con un pobres pronóstico para el paciente, así como con la capacidad de respuesta a la terapia. (L. Harris et al., 1999, Int., J. Biol., Markers, 14: 8 - 15, y J. Mendelsohn y J. Baselga, 2000, Oncogene,

19: 6550 - 6565) .

El EGFR se compone de tres dominios principales, a saber, el dominio extracelular (ECD) , que está glicosilado y contiene el bolsillo que enlaza al ligando con dos regiones ricas en cisteína; un dominio transmembrana corto, y un dominio intracelular que tiene actividad intrínseca de tirosina quinasa. La región transmembrana une el dominio de enlazamiento del ligando con el dominio intracelular. El análisis de secuencia de aminoácidos y de ADN, así como los estudios de las formas no glicosiladas de EGFR, indican que el esqueleto de la proteína del EGFR tiene una masa de 132 kDa, con 1186 residuos de aminoácidos (A. L. Ullrich et al., 1984, Nature, 307: 418 - 425; J. Downward et al., 1984, Nature, 307: 521 - 527; C. R. Carlin et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6: 257 - 264; y F. L. V. Mayes y M. D. Waterfield, 1984, The EMBO J., 3: 531 - 537) .

El enlazamiento de EGF o TGF-a con EGFR activa una ruta de transducción de la señal y trae como resultado la proliferación celular. La dimerización, los cambios conformacionales y la internalización de las moléculas de EGFR funcionan para transmitir señales intracelulares que conducen a la regulación del crecimiento celular (G. Carpenter y

S. Cohen, 1979, Ann. Rev. Biochem., 48: 193 - 216) . Las alteraciones genéticas que afectan la regulación de la función del receptor del factor de crecimiento, o que conducen a la sobreexpresión del receptor y/o del ligando, dan como resultado la proliferación celular. Además, se ha determinado que el EGFR desempeña un papel en la diferenciación celular, la mejora de la movilidad celular, la secreción de proteína, la neovascularización, invasión, metástasis y resistencia de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos y de radiación. (M. -J. Oh et al., 2000, Clin. Cancer Res., 6: 4760 - 4763) .

Se han identificado una variedad de inhibidores de EGFR, incluyendo una cantidad que ya ha sometida a ensayos clínicos para el tratamiento de varios tipos de cáncer. Para ver un resumen reciente, véase de Bono, J. S. y Rowinsky, E. K. (2002) , "The ErbB receptor Family: A Therapeutic Targer for Cancer", Trends in Molecular Medicine, 8, S 19 - 26.

Un conjunto prometedor de objetivos para la intervención terapéutica en el tratamiento del cáncer incluye los miembros del eje de quinasa HER. Se favorece frecuentemente su expresión en tumores epiteliales sólidos, por ejemplo, de la próstata, de pulmón y de mama, y también se favorece su expresión en los tumores de glioblastoma. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es un miembro del eje de la quinasa HER, y ha sido el objetivo de elección para el desarrollo de varias terapias diferentes contra el cáncer. Los inhibidores de la tirosina quinasa del EGFR (EGFR-TKI) se encuentran entre estas terapias, ya que se requiere la fosforilación reversible de los residuos de tirosina para la activación de la ruta del EGFR. En otras palabras, los EGFR-TKI bloquean un receptor de la superficie celular responsable de la activación y / o el mantenimiento de la ruta de señalización celular que induce el crecimiento de células tumorales y la división. Específicamente, se cree que estos inhibidores interfieren con el dominio quinasa de EGFR, denominado como HER-1. Entre los EGFR-TKI más prometedores están tres series de compuestos: quinazolinas, piridopirimidinas y pirrolopirimidinas.

Dos de los compuestos más avanzados en el desarrollo clínico incluyen el Gefitinib (compuesto ZD1839 desarrollado por AstraZeneca UK Ltd.; disponible bajo el nombre comercial IRESSA; en lo sucesivo, "IRESSA") y Erlotinib (compuesto OSI-774 desarrollado por Genentech, Inc. y OSI Pharmaceuticals, Inc.; disponible bajo el nombre comercial de TARCEVA; en lo sucesivo, "TARCEVA") , ambos han generado resultados clínicos alentadores. El tratamiento convencional contra el cáncer tanto con IRESSA como con TARCEVA supone la administración oral diaria de no más de 500 mg de los compuestos respectivos. En mayo de 2003, IRESSA se convirtió en el primero de estos productos en llegar al mercado de los Estados Unidos, cuando fue aprobado para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón avanzado de células no pequeñas.

IRESSA es una quinazolina oralmente activa que funciona inhibiendo en forma directa la fosforilación de la tirosina quinasa en la molécula del EGFR. Compite por el sitio de enlazamiento del trifosfato de adenosina (ATP) , conduciendo a la supresión del eje de la quinasa HER. El mecanismo exacto de la respuesta de la IRESSA no es completamente entendido, sin embargo, los estudios sugieren que la presencia del EGFR es un prerrequisito necesario para su acción.

Una limitación significativa en el uso de estos compuestos es que los receptores de los mismos pueden desarrollar una resistencia a sus efectos terapéuticos después de que inicialmente responden a la terapia, o pueden no responder a los EGFR-TKI en ningún grado medible en absoluto.... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar la probabilidad de efectividad de un inhibidor de tirosina quinasa del EGFR para tratar cáncer en un paciente afectado con cáncer, que comprende: determinar si el gen erbB1 obtenido a partir de una muestra biológica obtenida de dicho paciente comprende al menos una variación de ácido nucleico, seleccionado de:

a. una mutación en el exón 18 que resulta en una sustitución de cisteína por glicina en la posición 719 de la SEQ ID NO: 763 (G719C) o en una sustitución de serina por glicina en la posición 719 de la SEQ ID NO: 763 (G719S) ;

b. una supresión en el marco en el exón 19 que resulta en una supresión de al menos los aminoácidos leucina, arginina, ácido glutámico y alanina en los codones 747, 748, 749, y 750 de la SEQ ID NO: 763; o

c. una mutación en el exón 21 que resulta en una sustitución de aminoácido de arginina por leucina en la posición 858 de la SEQ ID NO: 763 (L858R) o de glutamina por leucina en la posición 861 de la SEQ ID NO: 763 (L861Q) ;

en donde la muestra biológica es una muestra de tejido o de fluido aislada del paciente y en donde la presencia de al menos una variación de ácido nucleico indica que el inhibidor de tirosina quinasa del EGFR es probable que sea efectivo; y en donde el cáncer se selecciona de cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , cáncer del sistema nervioso, cáncer de riñón, cáncer de retina, cáncer de piel, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer genitourinario y cáncer de vejiga.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra biológica se selecciona de sangre, plasma, suero, biopsia del tumor, orina, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, aspirados de pezón, fluido linfático, las secciones externas de la piel, las vías respiratorias, resección intestinal y genitourinaria, biopsia broncoscópica y bloque de células del líquido pleural.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es una anilinoquinazolina.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es una anilinoquinazolina sintética.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es gefitinib.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es erlotinib.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es un inhibidor irreversible de la tirosina quinasa.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el cáncer es NSCLC.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la mutación en el exón 18 que resulta en G719C comprende una sustitución de timina por guanina en el nucleótido 2155 de la SEQ ID NO: 763.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la mutación en el exón 18 que resulta en G719S comprende una sustitución de adenina por guanina en el nucleótido 2155 de la SEQ ID NO: 763.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los aminoácidos 746 - 750 de la SEQ ID NO: 763.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2235 - 2249 de la SEQ ID NO: 763.

13. El método de la reivindicación 11, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2240 - 2251 de la SEQ ID NO: 763.

14. El método de la reivindicación 11, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2240 - 2257 de la SEQ ID NO: 763.

15. El método de la reivindicación 11, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2239 - 2247 de la SEQ ID NO: 763, junto con una sustitución de citosina por guanina en el nucleótido 2248 de la SEQ ID NO: 763.

16. El método de la reivindicación 11, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2240 - 2250 de la SEQ ID NO: 763.

17. El método de la reivindicación 11, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2239 - 2250 de la SEQ ID NO: 763, junto con una sustitución de citosina por adenina en el nucleótido 2251 de la SEQ ID NO: 763.

18. El método de la reivindicación 11, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2238 - 2255 de la SEQ ID NO: 763, junto con una sustitución de timina por adenina en el nucleótido 2237 de la SEQ ID NO: 763.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la mutación en el exón 21 comprende una sustitución de guanina por timina en el nucleótido 2573 de la SEQ ID NO: 763.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la mutación en el exón 21 comprende una sustitución de adenina por timina en el nucleótido 2582 de la SEQ ID NO: 763.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde determinar si el gen erbB1 comprende al menos una variación de ácido nucleico utiliza ADN o ARN recolectado de muestras biológicas y se lleva a cabo por medio de la reacción de cadena de la polimerasa (PCR) , hibridación con sondas específicas del alelo, detección de la mutación enzimática, escisión química de las faltas de correspondencia, espectrometría de masas o secuenciación de ADN.

22. El método de la reivindicación 21, en donde en la PCR se separan los productos de la amplificación utilizando diferencias de secuencia, usando polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP) , electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) , electroforesis en gel sensible a la temperatura (TSGE) , escisión química o polimorfismos de fragmentos de restricción, o hibridación con una matriz de ácido nucleico.

23. Un inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR para uso en un método de tratamiento del cáncer en un paciente afectado con cáncer, comprendiendo el método: determinar a partir de una muestra biológica obtenida del paciente si el dominio quinasa del gen erbB1 del paciente comprende al menos una variación de ácido nucleico que indica que un tratamiento dirigido al EGFR será efectivo en el paciente, en donde la muestra biológica es una muestra de tejido o de fluido aislada del paciente y la variación se selecciona de variaciones como se define en la reivindicación 1 (a) , reivindicación 1 (b) y reivindicación 1 (c) ; y administrar una cantidad efectiva del inhibidor de la tirosina quinasa a dicho paciente; en donde

el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, NSCLC, cáncer del sistema nervioso, cáncer de riñón, cáncer de retina, cáncer de piel, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer genitourinario y cáncer de vejiga.

24. El inhibidor de la tirosina quinasa para su uso como en la reivindicación 23, en donde la muestra biológica se selecciona de sangre, plasma, suero, biopsia de tumor, orina, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, aspirados de pezón, fluido linfático, las secciones externas de la piel, tracto respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células, tumores, órganos, resección, biopsia broncoscópica y bloques de células del líquido pleural.

25. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 y 24, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es una anilinoquinazolina.

26. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es una anilinoquinazolina sintética.

27. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 y 24, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es gefitinib.

28. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 y 24, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es erlotinib.

29. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 y 24, en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es un inhibidor irreversible de la tirosina quinasa.

30. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 y 24, en donde el cáncer es NSCLC.

31. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, en donde la mutación en el exón 18 que resulta en G719C comprende una sustitución de timina por guanina en el nucleótido 2155 de la SEQ ID NO: 763.

32. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, en donde la mutación en el exón 18 que resulta en G719S comprende una sustitución de adenina por guanina en el nucleótido 2155 de la SEQ ID NO: 763.

33. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los aminoácidos 746 - 750 de la SEQ ID NO: 763.

34. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en la reivindicación 33, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2235 - 2249 de la SEQ ID NO: 763.

35. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en la reivindicación 33, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2240 - 2251 de la SEQ ID NO: 763.

36. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en la reivindicación 33, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2240 - 2257 de la SEQ ID NO: 763.

37. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en la reivindicación 33, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2239 - 2247 de la SEQ ID NO: 763, junto con una sustitución de citosina por guanina en el nucleótido 2248 de la SEQ ID NO: 763.

38. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en la reivindicación 33, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2240 - 2250 de la SEQ ID NO: 763.

39. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en la reivindicación 33, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2239 - 2250 de la SEQ ID NO: 763, junto con una sustitución de citosina por adenina en el nucleótido 2251 de la SEQ ID NO: 763.

40. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en la reivindicación 33, en donde la supresión en el marco en el exón 19 comprende una supresión de los nucleótidos 2238 - 2255 de la SEQ ID NO: 763, junto con una sustitución de timina por adenina en el nucleótido 2237 de la SEQ ID NO: 763.

41. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, en donde la mutación en el exón 21 comprende una sustitución de guanina por timina en el nucleótido 2573 de la SEQ ID NO:

763.

42. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, en donde la mutación en el exón 21 comprende una sustitución de adenina por timina en el nucleótido 2582 de la SEQ ID NO:

763.

43. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 42, en donde la determinación del dominio quinasa del gen erbB1 de dicho paciente que contiene una forma del gen erbB1 que comprende al menos una variación de ácido nucleico seleccionada de las variaciones como se define en la reivindicación 1 (a) , reivindicación 1 (b) y reivindicación 1 (c) utiliza ADN o ARN recolectado de muestras biológicas y se realiza por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , hibridación con sondas específicas del alelo, detección de la mutación enzimática, escisión química de las faltas de correspondencia, espectrometría de masas o secuenciación de ADN.

44. El inhibidor de la tirosina quinasa para uso como en la reivindicación 43, en donde en la PCR se separan los productos de amplificación utilizando diferencias de secuencia, usando un polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) , electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) , electroforesis en gel sensible a la temperatura (TSGE) , escisión química o polimorfismos del fragmento de restricción, o hibridación con una matriz de ácido nucleico.

Figura 5 Figura 5 (continuación) Figura 5 (continuación) Figura 5 (continuación)