Método de configuración de un instrumento para un analizador de fluorescencia.

Un método para determinar, en un instrumento para analizar una multiplicidad de colorantes fluorescentesusando una multiplicidad de canales de detección que tienen ganancias ajustables del fotodetector,

undesbordamiento de un colorante fluorescente en un canal de detección secundario, en el que un espectro deemisión de dicho colorante está relacionado más estrechamente con un canal de detección primario, en el que elrebasamiento es específico de un conjunto final de parámetros de ganancia del fotodetector;

en el que el método comprende:

a) proporcionar un material de referencia fluorescente que emite en dichos canales de detección primario ysecundario;

b) determinar un valor de desbordamiento calibrado midiendo, usando dicho instrumento ajustado a unprimer conjunto de parámetros de ganancia del fotodetector, las emisiones de dicho colorante y de dichomaterial de referencia en dichos canales de detección primario y secundario, y calcular dicho valor dedesbordamiento calibrado a partir de las emisiones medidas desde dicho colorante usando la emisiónmedida desde dicho material de referencia;

c) posteriormente, medir, usando dicho instrumento ajustado a dicho conjunto final de parámetros deganancia del fotodetector en el que dicho primer conjunto de parámetros de ganancia del fotodetector ydicho conjunto final de parámetros de ganancia del fotodetector son diferentes, las emisiones de medición dedicho material de referencia en dicho canal de detección primario para obtener un primer valor de referenciay en dicho canal de detección secundario para obtener un segundo valor de referencia;

d) determinar dicho desbordamiento en dicho canal de detección secundario de dicho colorante a partir dedicho valor de desbordamiento calibrado calculado en la etapa b) y dichos valores de referencia primero ysegundo medidos en la etapa c).

Método de configuración de un instrumento para un analizador de fluorescencia Antecedentes de la Invención Campo de la Invención La presente invención se refiere a instrumentos para analizar una multiplicidad de colorantes fluorescentes usando una multiplicidad de fotodetectores. La presente invención es particularmente aplicable al campo de la citometría, más particularmente, la citometría de flujo o de barrido.

Descripción de la técnica relacionada Los analizadores de partículas, tales como citómetros de flujo y de barrido, son bien conocidos en la técnica. En estos sistemas, las partículas marcadas con fluorescencia, tales como moléculas, perlas unidas a analito, o células individuales, se analizan individualmente exponiendo cada partícula a una luz de excitación, típicamente uno o más láseres, y midiendo la fluorescencia resultante desde cada una de las marcas de colorante. Cada partícula puede ser marcada con una multiplicidad de colorantes fluorescentes espectralmente distintos. Típicamente, la detección se lleva a cabo usando una multiplicidad de fotodetectores, uno para cada colorante distinto a detectar. Ambos citómetros de flujo y de barrido están disponibles comercialmente, por ejemplo, en BD Biosciences (San José, CA) .

Se conocen otros sistemas de instrumentos que son capaces de detectar una multiplicidad de colorantes fluorescentes usando una multiplicidad de fotodetectores. Por ejemplo, los productos de reacción de la amplificación de ácidos nucleicos a partir de múltiples secuencias diana pueden ser detectados y distinguidos usando sondas marcadas con fluorescencia, en las que cada sonda específica de diana está unida a un colorante espectralmente distinto. Típicamente, un instrumento para analizar los productos de amplificación de ácidos nucleicos mide la fluorescencia total desde una mezcla de reacción, y la frecuencia de cada especie diana es determinada a partir de la fluorescencia medida desde cada colorante.

En los citómetros de flujo y otros instrumentos que emplean una multiplicidad de fotodetectores para detectar una multiplicidad de colorantes, la luz recogida es separada en intervalos específicos de longitudes de onda, típicamente por un sistema de filtros dependientes de la frecuencia y espejos dicroicos, de manera que la luz detectada por un fotodetector particular es limitada a un rango predefinido de longitudes de onda, denominado canal de detección. Los canales de detección y los colorantes se seleccionan de manera que el pico del espectro de emisión de cada colorante esté dentro del rango de frecuencias de un canal de detección diferente, es decir, cada canal de detección detecta principalmente la emisión desde un único colorante. Sin embargo, debido a que la amplitud de los espectros de emisión de los colorantes fluorescentes, típicamente, un colorante emitirá fuorescencia en más de un canal de detección y, de esta manera, las mediciones de fluorescencia del colorante no son independientes. La emisión de un colorante en los canales de detección destinados a la detección de otros colorantes es conocida por un número de términos, tales como desbordamiento, superposición espectral de fluorescencia y diafonía.

Los métodos para reducir el efecto de desbordamiento o diafonía en las mediciones de fluorescencia de colorantes son conocidos en la técnica. Dichos métodos implican el ajuste de la señal medida por cada fotodetector en una cantidad calculada para compensar la contribución desde colorantes diferentes al colorante principal a detectar. Los ejemplos en el campo de la citometría de flujo incluyen Bagwell, C.B.; Adams, E.G. "Fluorescence Spectral Overlap Compensation for any Number of Flow Cytometer Parameters", Ann. N.Y. Acad. Sci. 677, 167-184 (1993) ; Roederer, M. et al., "Eight Color, 10-Parameter Flow Cytometr y to Elucidate Complex Leukocyte Hetrogeneity", Cytometr y 29, 328-339 (1997) ; y Bigos et al., 1999, Cytometr y 36: 36-45. Los paquetes de software de análisis de datos, disponibles comercialmente, tales como WinList® (Verity Software House, Topsham, Maine) , FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR) y FCS Express (De Novo Software, Los Angeles, CA) permiten una compensación mediante software en los archivos de datos almacenados producidos por un citómetro de flujo. Véase también el documento técnico que describe la BD FACSDiVa™ Option para el citómetro de flujo BD FACSVantage SE (BD Biosciences, San Jose, CA, disponible en (www.bdbiosciences.com) .

En un análisis de citometría de flujo típico, las partículas marcadas suspendidas en un medio líquido se hacen pasar a través de un canal estrecho, de una en una, pasando por una región de interrogación. Las partículas se marcan con uno o más colorantes fluorescentes para facilitar la identificación. Mientras pasan por la región de interrogación, las partículas marcadas son expuestas a la luz de excitación, típicamente, desde uno o más láseres, y se mide la fluorescencia resultante de las partículas. Típicamente, también se mide la cantidad de luz de excitación dispersada por las partículas. La cantidad de luz dispersada y la intensidad de la luz fluorescente emitida desde cada una de las marcas unidas proporcionan una caracterización de las partículas marcadas. La citometría de flujo proporciona un medio rápido para analizar un gran número de partículas y, de manera importante, 2 10

proporciona datos sobre cada partícula individual, en lugar de sólo acerca de la población de partículas en su conjunto. Sin embargo, la detección de un bajo nivel de luz emitida por las moléculas de colorante unidas a una única partícula requiere, típicamente, una amplificación de la señal detectada. Para detectar dichos niveles bajos de luz emitida, los citómetros de flujo actuales usan fotodetectores tales como tubos fotomultiplicadores (PMT) y fotodiodos de avalancha (APD) que son capaces de amplificar la señal por un factor de 106 o mayor. La ganancia de amplificación de un PMT o APD puede ser variada ajustando un voltaje de entrada al detector, o ajustando la ganancia de un amplificador situado aguas abajo, o ambos.

Típicamente los instrumentos para la detección de productos de amplificación de ácidos nucleicos marcados miden los productos marcados a nivel de población, en lugar de a nivel de partículas individuales, y el grado de amplificación requerido de la señal depende del volumen de la muestra analizada. La amplificación de señal, si se usa, puede conseguirse usando un amplificador en línea con la salida del detector. Como con un PMT o APD, típicamente, la ganancia de la amplificación es ajustable.

Antes de llevar a cabo un ensayo particular, usando un citómetro de flujo, la amplificación de la señal del fotodetector (ganancia) y el rango de la señal detectada se ajustan en base al brillo/cantidad de colorantes a detectar con el fin de que las mediciones de las muestras estén dentro del rango dinámico del sistema de detección. Para proporcionar la máxima resolución del nivel de fluorescencia de las muestras, es deseable que la ganancia del fotodetector y el rango de la señal detectada se fijen de manera que el rango esperado de la fluorescencia de la muestra se extienda en una parte considerable del rango detectable. Debido a que el rango esperado de la fluorescencia de la muestra es específico de la muestra, estos parámetros del instrumento deben ser determinados y establecidos antes de analizar cada tipo de muestra. Además, estos parámetros son específicos del instrumento, ya que los instrumentos individuales diferirán en su rendimiento.

Típicamente, la ganancia del fotodetector y el rango de la señal detectada se establecen en un citómetro de flujo analizando muestras de estándares que son representativos de la muestra desconocida a analizar posteriormente. Por ejemplo, antes de analizar una muestra que contiene células, una muestra de perlas o células tintadas con una cantidad de colorante representativa de la luminosidad esperada de una célula tintada con colorante brillante se usa para establecer el extremo superior del rango de detección, o una muestra de perlas o células no marcadas, que emiten fluorescencia a un nivel de una célula de muestra no marcada, se usa para establecer el extremo inferior del rango de detección. Típicamente, esta determinación de los parámetros apropiados se realiza todos los días, incluso si todos los días debe realizarse el mismo tipo de análisis, en parte debido a la variación de un día a otro en el rendimiento del instrumento y del fotodetector.

Debido a que los niveles de ganancia del fotodetector en cada uno de los múltiples fotodetectores afecta a la medición de la luz en cada canal, la cantidad de fluorescencia... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar, en un instrumento para analizar una multiplicidad de colorantes fluorescentes usando una multiplicidad de canales de detección que tienen ganancias ajustables del fotodetector, un desbordamiento de un colorante fluorescente en un canal de detección secundario, en el que un espectro de emisión de dicho colorante está relacionado más estrechamente con un canal de detección primario, en el que el rebasamiento es específico de un conjunto final de parámetros de ganancia del fotodetector; en el que el método comprende:

a) proporcionar un material de referencia fluorescente que emite en dichos canales de detección primario y secundario; b) determinar un valor de desbordamiento calibrado midiendo, usando dicho instrumento ajustado a un primer conjunto de parámetros de ganancia del fotodetector, las emisiones de dicho colorante y de dicho material de referencia en dichos canales de detección primario y secundario, y calcular dicho valor de desbordamiento calibrado a partir de las emisiones medidas desde dicho colorante usando la emisión medida desde dicho material de referencia; c) posteriormente, medir, usando dicho instrumento ajustado a dicho conjunto final de parámetros de ganancia del fotodetector en el que dicho primer conjunto de parámetros de ganancia del fotodetector y dicho conjunto final de parámetros de ganancia del fotodetector son diferentes, las emisiones de medición de dicho material de referencia en dicho canal de detección primario para obtener un primer valor de referencia y en dicho canal de detección secundario para obtener un segundo valor de referencia; d) determinar dicho desbordamiento en dicho canal de detección secundario de dicho colorante a partir de dicho valor de desbordamiento calibrado calculado en la etapa b) y dichos valores de referencia primero y segundo medidos en la etapa c) .

2. El método según la reivindicación 1, en el que dichas mediciones de las emisiones desde dicho colorante fluorescente se realizan usando un estándar de fluorescencia.

3. El método según la reivindicación 2, en el que dicho estándar de fluorescencia comprende partículas marcadas con dicho colorante fluorescente.

4. El método según la reivindicación 3, en el que dicho estándar de fluorescencia comprende partículas tintadas en duro, marcadas con dicho colorante fluorescente.

5. El método según la reivindicación 2, en el que dicho estándar de fluorescencia comprende células en una muestra de sangre, en el que dichas células son tintadas con un anticuerpo marcado con dicho colorante fluorescente.

6. Método según la reivindicación 5, en el que dichas células son linfocitos CD4+ en una muestra de sangre humana fija y dicho anticuerpo se une a CD4.

7. El método según la reivindicación 1, en el que dicho material de referencia comprende micropartículas marcadas con una pluralidad de colorantes fluorescentes.

8. El método según la reivindicación 1, en el que dicho instrumento es un citómetro de flujo.

9. El método de determinación de una compensación en un instrumento para analizar una multiplicidad de colorantes fluorescentes usando una multiplicidad de canales de detección que tienen ganancias de fotodetector ajustables, en el que, para cada uno de dichos fotodetectores, uno de dichos colorantes fluorescentes es un colorante primario, en el que el método comprende:

a) obtener los valores de desbordamiento, específicos de dicho conjunto final de parámetros de ganancia del fotodetector, en cada uno de dichos canales del detector para cada uno de dichos colorantes fluorescentes usando el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; y b) calcular la compensación para dicho conjunto final de parámetros de ganancia del fotodetector a partir de dichos valores de desbordamiento.