Marcadores para la predicción del resultado de un tratamiento con antraciclina.

Método para predecir el resultado de tratamiento con antraciclinas de un sujeto con un trastorno proliferativocelular de la mama,

que comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto ADN genómico aislado de la muestra biológica con al menos un reactivo, o serie dereactivos que distinguen entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados;

b) determinar, basándose en la puesta en contacto, un estado de metilación de al menos una secuenciadinucleotídica de CpG de al menos un gen y/o secuencia genómica seleccionadas del grupo que consiste enPITX2 y PLAU y/o sus secuencias reguladoras en dicha muestra, y

c) proporcionar, basándose en el estado de metilación determinado, una predicción del resultado de untratamiento que comprende al menos una antraciclina de dicho sujeto con un trastorno proliferativo celular dela mama.

Marcadores para la predicción del resultado de un tratamiento con antraciclina.

La presente invención se refiere a métodos para predecir el resultado del tratamiento con antraciclina, caracterizados porque se determinan las modificaciones epigenéticas del ADN genómico asociado con dichos genes y/o secuencias genómicas y/o regiones reguladoras o promotoras del mismo. La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos, a oligonucleótidos y a anticuerpos que se pueden usar en los métodos descritos.

Campo de la invención Las antraciclinas son un gran grupo de compuestos sintetizados por diferentes especies de Streptomyces. Poseen actividad antibiótica y tienen efectos citotóxicos sobre las células eucariotas. Todas las antraciclinas tienen una estructura de anillo de tetrahidronaftacendiona unida mediante un enlace glicosídico a una molécula de azúcar, y la diversidad estructural de las antraciclinas está generada por modificaciones de la cadena principal que incluye un gran número de diferentes cadenas laterales.

Las antraciclinas tienen una excelente actividad antineoplásica en escenarios metastásicos, neoadyuvantes y adyuvantes, y se usan en el tratamiento de diversos tumores hematopoyéticos y sólidos. Las antraciclinas usadas habitualmente incluyen, pero no se limitan a, mitoxantrona, doxorrubicina, aclarrubicina, daunorrubicina, epirrubicina e idarrubicina. Aunque su mecanismo de acción terapéutica es incierto, implica la intercalación de ADN no covalente, la formación de aductos de ADN covalentes, el envenenamiento de topoisomerasa II (topo II) , y efectos de radicales libres sobre membranas celulares y ADN. Sin embargo, la utilidad clínica de las antraciclinas está limitada debido a toxicidades agudas y crónicas, particularmente cardiotoxicidad, mielosupresión, náuseas y vómitos, y alopecia.

La insuficiencia cardíaca tras la terapia con antraciclinas es un problema clínico importante en el tratamiento de cáncer. El establecimiento de predictores del resultado del tratamiento con antraciclinas permitiría la identificación y exclusión de individuos que no se beneficiarían de dicho tratamiento, y de este modo incrementaría la seguridad del tratamiento con antraciclinas. Además, determinando qué pacientes se beneficiarían del tratamiento con antraciclinas, pero en el que dicho resultado predicho es subóptimo, se podrían recomendar pacientes para tratamientos quimioterapéuticos u otros tratamientos posteriores. Contrariamente, determinando qué pacientes serían tratados adecuadamente mediante el tratamiento con antraciclina solo, se puede evitar el sobretratamiento de los pacientes. En consecuencia, existe una necesidad largamente sentida en la técnica a la hora de determinar qué pacientes se beneficiarían del tratamiento con antraciclinas.

La metilación del gen Topo IIalfa se observó recientemente en la estirpe celular K562/MX2, que presenta resistencia a las antraciclinas KRN 8602 (MX2) , etopósido y doxorrubicina (Asano et al. Br J Cancer. 25 de abril de 2005; 92 (8) :1486-92.) . La sensibilidad al fármaco se restauró mediante tratamiento con el agente desmetilante 5-aza-2’desoxicitidina, implicando de ese modo que la metilación de Topo IIalfa es un mecanismo de resistencia a fármacos. El experto en la materia, cuando considere el documento WO 2004/035803 a partir de Asano et al., no tendrá una expectativa razonable de éxito de que un marcador de metilación indicativo de la respuesta a tratamiento dirigido contra la ruta de hormonas sería un predictor de la respuesta a un tratamiento con un mecanismo de acción no relacionado.

La presente invención proporciona un nuevo método para predecir el resultado del tratamiento con antraciclinas de un paciente con un trastorno proliferativo celular de la mama determinando el estado de metilación de CpG de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en PITX2 y PLAU, y predecir a partir de él el resultado del tratamiento con antraciclinas.

Las diferencias técnicas entre el estado de la técnica y la presente invención son que la presente invención proporciona un medio para la predicción del tratamiento con antraciclinas por medio del análisis de la metilación de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en PITX2 y PLAU. Su efecto técnico consiste en proporcionar un predictor del resultado del tratamiento específico para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular de la mama en oposición a otros tratamientos que se pueden tratar por medio de antraciclinas.

De este modo, el problema técnico objetivo resuelto por el método de la presente invención es predecir el resultado del tratamiento con antraciclinas de un trastorno proliferativo celular de la mama.

Técnica anterior en el análisis de metilación La 5-metilcitosina es la modificación de base covalente más frecuente en el ADN de células eucariotas. La metilación del ADN puede desempeñar un papel importante en el control de la expresión génica en células de mamíferos. Por ejemplo, desempeña un papel en la regulación de la transcripción, en la impresión genética, y en tumorigénesis. En la metilación del ADN están implicadas las metiltransferasas de ADN, y catalizan la transferencia de un grupo metilo desde S-adenosilmetionina hacia restos de citosina para formar 5-metilcitosina, una base modificada que se encuentra mayoritariamente en sitios de CpG en el genoma. La presencia de islas de CpG metiladas en la región promotora de genes puede suprimir su expresión. Este proceso puede ser debido a la presencia de 5-metilcitosina, que aparentemente interfiere con la unión de factores de transcripción u otras proteínas de unión al ADN para bloquear la transcripción. En diferentes tipos de tumores, se ha observado la metilación aberrante o accidental de islas de CpG en la región promotora para muchos genes relacionados con cáncer, dando como resultado el silenciamiento de su expresión. Tales genes incluyen genes supresores de tumores, genes que suprimen metástasis y angiogénesis, y genes que reparan el ADN (Momparler y Bovenzi (2000) J. Cell Physiol. 183:145-54) . Por lo tanto, la identificación de 5-metilcitosina como componente de la información genética es de considerable interés. Sin embargo, las posiciones de 5-metilcitosina no se pueden identificar secuenciando, puesto que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de emparejamiento de bases que la citosina. Además, la información epigenética portada por la 5-metilcitosina se pierde completamente durante la amplificación con la PCR.

Las figuras 1 a 78 muestran las curvas de supervivencia libres de enfermedad estimadas de Kaplan-Meier para ensayos individuales o combinaciones de ensayos según el Ejemplo 2 y la tabla 5. La gráfica negra muestra la proporción de pacientes libres de la enfermedad en el conjunto de muestras con niveles de metilación de corte por encima de la mediana u optimizados, la gráfica gris muestra la proporción de pacientes libres de la enfermedad en la población con niveles de metilación de corte por debajo de la mediana u optimizado. También se indica en cada gráfica el número de sucesos (es decir, metástasis) y el número de individuos en cada uno de los dos conjuntos. La proporción de pacientes libres de metástasis se muestra en el eje Y, el tiempo en años se muestra en el eje X.

Descripción La caracterización de un cáncer en términos de predecir el resultado del tratamiento permite al médico tomar una decisión informada en cuanto al régimen terapéutico con los compromisos de riesgo y beneficio apropiados para el paciente.

En el contexto de la presente invención, las expresiones “positivo al receptor de estrógeno” y/o “positivo al receptor de progesterona”, cuando se usan para describir un trastorno proliferativo celular, se utilizan para hacer referencia las células proliferantes expresan dicho receptor de hormonas.

En el contexto de la presente invención, el término “agresividad” hace referencia a uno o más de entre probabilidad elevada de poscirugía de recaída; supervivencia por debajo de la media o por debajo de la mediana del paciente; supervivencia por debajo de la media o por debajo de la mediana libre de la enfermedad; supervivencia por debajo de la media o por debajo de la mediana libre de recaídas; complicaciones por encima de la media relacionadas con el tumor; progresión rápida de tumor o metástasis. Según la agresividad de la enfermedad, se puede seleccionar un tratamiento o tratamientos apropiados a partir del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia, cirugía, terapia biológica, inmunoterapia, tratamientos con anticuerpos, tratamientos que implican fármacos dirigidos (targeted) molecularmente,... [Seguir leyendo]

1. Método para predecir el resultado de tratamiento con antraciclinas de un sujeto con un trastorno proliferativo celular de la mama, que comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto ADN genómico aislado de la muestra biológica con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados;

b) determinar, basándose en la puesta en contacto, un estado de metilación de al menos una secuencia dinucleotídica de CpG de al menos un gen y/o secuencia genómica seleccionadas del grupo que consiste en PITX2 y PLAU y/o sus secuencias reguladoras en dicha muestra, y

c) proporcionar, basándose en el estado de metilación determinado, una predicción del resultado de un tratamiento que comprende al menos una antraciclina de dicho sujeto con un trastorno proliferativo celular de la mama.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa siguiente:

c) determinar un régimen de tratamiento adecuado para dicho sujeto.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho régimen de tratamiento adecuado comprende una o más terapias seleccionadas del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia, cirugía, terapia biológica, inmunoterapia, anticuerpos, fármacos dirigidos molecularmente, moduladores del receptor de estrógeno, reguladores a la baja del receptor de estrógeno, inhibidores de aromatasas, ablación ovárica, análogos de LHRH y otros fármacos que actúan de forma central que influyen en la producción de estrógeno.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en estirpes celulares, portaobjetos histológicos, tejidos embebidos en parafinas, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, aspirado del pezón, sangre, y todas sus posibles combinaciones.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende poner en contacto ADN genómico aislado de dicha muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos de CpG metilados y no metilados en al menos una región diana del ADN genómico, en el que la región diana comprende o se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en PITX2 y PLAU y/o sus regiones reguladoras, en el que dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia dinucleotídica de CpG, y permitiéndose así al menos en parte predecir el resultado del tratamiento con antraciclinas de los trastornos proliferativos celulares de la mama.

6. Método para predecir el resultado del tratamiento con antraciclinas de un sujeto con un trastorno proliferativo celular de la mama según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que las etapas a) y b) de la reivindicación 1 se llevan a cabo

a) aislando ADN genómico de una muestra biológica tomada de un sujeto;

b) tratando dicho ADN genómico, o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos, a fin de convertir las bases citosínicas no metiladas de la posición 5 en uracilo u otra base que es detectablemente diferente de la citosina en términos de propiedades de hibridación;

c) poner en contacto dicho ADN genómico tratado, o su fragmento tratado, con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden en cada caso una secuencia contigua de al menos 18 nucleótidos de longitud que es complementaria a o se hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 9-12, 15-20.

2. 28 .

3. 36 y sus complementos, en el que el ADN tratado o un fragmento del mismo se amplifica para producir uno o más amplificados, o no se amplifica;

d) determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en la cantidad o en una propiedad de dicho amplificado, el estado de metilación de al menos una secuencia dinucleotídica de CpG de al menos un gen y/o secuencia genómica seleccionados del grupo que consiste en PITX2 y PLAU, o una media, o un valor que refleja un estado medio de metilación de una pluralidad de secuencias dinucleotídicas de CpG de al menos un gen y/o secuencia genómica seleccionados del grupo que consiste en PITX2 y PLAU, y

e) determinar a partir de dicho estado de metilación el resultado del tratamiento que comprende al menos una antraciclina de dicho sujeto, en el que la hipermetilación es indicativa de un pronóstico negativo.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dichos uno o más reactivos comprenden una disolución seleccionada del grupo que consiste en bisulfito, hidrogenosulfito, disulfito, y sus combinaciones.

8. Método según la reivindicación 6 o 7, en el que la etapa d) se lleva a cabo por medio de uno o más métodos

tomados del grupo que consiste en análisis de hibridación de oligonucleótidos, Ms-SnuPE, secuenciación, sondas de detección en tiempo real, y análisis de matrices de oligonucleótidos.

9. Utilización de una composición que comprende: a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de al menos 18 bases de longitud de un segmento del ADN genómico químicamente pretratado según una de las secuencias 10 tomadas del grupo que comprende SEC ID NO: 9-12, 15-20.

2. 28 .

3. 36 y secuencias complementarias a las mismas, y b) un tampón que comprende al menos una de las sustancias siguientes: cloruro de magnesio, dNTP, Taq polimerasa, un oligómero, en particular un oligonucleótido o un oligómero de ácido nucleico peptídico (PNA) , comprendiendo dicho oligómero en cada caso al menos una secuencia de bases que presenta una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a o se hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas a un ADN genómico pretratado según una de las SEC ID NO: 9-12, 15-20.

2. 28 .

3. 36 y las secuencias complementarias a las mismas, en la predicción del resultado del tratamiento con antraciclinas de un sujeto con un trastorno proliferativo celular de la mama.