Procedimiento para la determinación de factor XIII por medio de análogos de NAD(P)H.

Procedimiento para la determinación de factor XIII en una muestra,

en el que

a) la muestra se combina con uno o varios reactivos que contienen

I. una substancia o una mezcla de substancias para la activación del factor XIII para dar el factorXIIIa,

II. un substrato aceptor para factor XIIIa con al menos un grupo glutaminilo,

III. un substrato donador de grupos amino para factor XIIIa,

IV. un análogo de NAD (P) H con un máximo de absorción que se sitúa por encima de 350 nm, y

V. un agente que, en presencia de amoniaco, es capaz de oxidar NAD (P) H para dar NAD (P) + o

un análogo de NAD (P) H para dar el correspondiente análogo de NAD (P) +,y

b) se mide la modificación de la absorción de la carga de ensayo, y siendo el análogo de NAD (P) H tio-NAD (P) H o seleno-NAD (P) H.

Procedimiento para la determinación de factor XIII por medio de análogos de NAD (P) H

La presente invención se sitúa en el campo del diagnóstico in vitro, y se refiere a un procedimiento para la determinación del factor de coagulación sanguíneo XIII (factor XIII, F XIII) , así como a un kit de ensayo para la puesta en práctica del procedimiento.

Factor XIII es un factor de coagulación sanguínea que actúa al final de la cascada de coagulación sanguínea, y juega un papel importante para la cicatrización de heridas duradera. En la última fase de la coagulación sanguínea, la formación de fibrina, trombina disocia fibrinógeno. Los monómeros de fibrina producidos de este modo se agregan espontáneamente a fibras largas, y finalmente a un retículo denso, ramificado, constituido por polímeros de fibrina solubles. También el factor XIII se activa mediante trombina, a través de lo cual se produce el factor XIII. El factor XIIIa ocasiona un reticulado transversal de los polímeros de fibrina, mediante lo cual el coágulo de fibrina se vuelve más estable mecánicamente, menos deformable y más resistente frente a disolución a través de plasmina. Una deficiencia de factor XIII congénita o adquirida puede conducir a tendencia a las hemorragias, cicatrización de heridas deficiente, así como a abortos. Debido a la relevancia clínica, la determinación de factor XIII es un componente importante del diagnóstico de coagulación para la determinación de una deficiencia de factor XIII.

El factor XIIIa, la forma activada de proenzima factor XIII sin actividad catalítica, es una trans-glutaminasa que cataliza la reticulación transversal tridimensional de polímeros de fibrina mediante formación de enlaces de amida intermoleculares entre cadenas laterales de aminoácido de lisilo y glutaminilo de las moléculas de fibrina. En esta reacción se produce amoniaco (NH3) , o bien se liberan iones amonio (NH4+) . Este fenómeno se aprovecha en diversos procedimientos de ensayo para la determinación de factor XIII: a continuación, el concepto amoniaco es sinónimo de amoniaco e iones amonio.

Muszbek, L. et al. [Clin. Chem. (1985) 31 (1) , 35-40] describen un procedimiento para la determinación de factor XIII en muestras de plasma desfibrinadas, activándose el factor XIII de la muestra con trombina para dar factor XIIIa. Además, la muestra se mezcla con º-caseína y etilamina, que sirven como substratos para la formación de enlaces de amida intermoleculares a través de factor XIIIa. Para identificar cuantitativamente amoniaco liberado en esta reacción, la muestra se mezcla adicionalmente con NADPH (amida de ácido nicotínico-adenina-dinucleótido-fosfatohíbrido) y con componentes de una reacción de indicador dependiente de NADPH, esto es, con glutamatodehidrogenasa (GLDH) y a-cetoglutarato. En presencia de amoniaco, GLDH transforma a-cetoglutarato en glutamato. Esta reacción consume adicionalmente NADPH, y se produce NADP+ (amida de ácido nicotínicoadenina-dinucleótido-fosfato) , la forma oxidada de NADPH. NADP+ tiene un espectro de absorción diferente que NADPH, de modo que la absorción (también llamada extinción o densidad óptica) de la carga de ensayo se modifica proporcionalmente al consumo de NADPH, y con ello proporcionalmente a la cantidad de amoniaco, y por consiguiente proporcional a la cantidad, o bien actividad de factor XIII. Alternativamente, en esta carga de ensayo se puede emplear NADH en lugar de NADPH. En contrapartida a NAD (P) +, NAD (P) H posee un máximo de absorción en aproximadamente 340 nm, además de un máximo de absorción en aproximadamente 260 nm. La posición exacta de máximos de absorción depende generalmente de diversos parámetros, en especial de las constantes de dielectricidad y del valor de pH de la disolución. En general, el máximo de absorción de NAD (P) H se sitúa en el intervalo de 335 a 345 nm. La medida de la modificación de la absorción de la carga de ensayo en una longitud de onda de 340 nm posibilita la determinación cuantitativa del factor XIII en una muestra.

La EP 336 353 A2, o bien Fickenscher et al. (Thromb Haemost. 1991, 65 (5) : 535-40) describen un procedimiento similar, con el que se cuantifica factor XIII a través del amoniaco liberado. La EP 336 353 A2 describe un procedimiento para la determinación de factor XIII en muestra de plasma no tratadas previamente, que contienen fibrina. Para suprimir la producción de coágulo de fibrina en la carga de reacción, la muestra se mezcla adicionalmente con un inhibidor de agregación de fibrina. El factor XIII de la muestra se activa con trombina en presencia de iones Ca2+ para dar el factor XIIIa. Además se mezcla la muestra con un péptido sintético, que contiene glutamina, y éster etílico de glicina, que sirven como substratos para la formación de enlaces de amida intermoleculares mediante factor XIIIa. Para identificar cuantitativamente el amoniaco liberado en esta reacción, la muestra se mezcla adicionalmente con NADH (amida de ácido nicotínico-adenina-dinucleótido-hidruro) y con componentes de una reacción de indicador dependiente de NADH, esto es, con glutamato-dehidrogenasa (GLDH) y a-cetoglutarato. En presencia de amoniaco, GLDH transforma a-cetoglutarato en glutamato. Esta reacción consume adicionalmente NADH, y se produce NAD+, la forma oxidada de NADH. NAD+ tiene un espectro de absorción diferente que NADH, de modo que la absorción de la carga de ensayo se modifica proporcionalmente al consumo de NADH, y con ello proporcionalmente a la cantidad de amoniaco, y por consiguiente proporcionalmente a la cantidad,

o bien actividad de factor XIII. Alternativamente, en esta carga de ensayo se puede emplear NADPH en lugar de NADH. La medida de la modificación de la absorción de la carga de ensayo a una longitud de onda de 340 nm posibilita la determinación cuantitativa del factor XIII en una muestra. Un ensayo comercial, que se basa en el principio de ensayo descrito en la EP 336 353 A2, es el ensayo Berichrom® F XIII de Siemens Healthcare Diagnostics.

Los procedimientos descritos tienen el inconveniente de ser relativamente sensibles frente a substancias interferentes intrínsecas de la muestra. Muestras de pacientes en casos aislados pueden contener concentraciones anómalamente elevadas de una o varias substancias intrínsecas, es decir, endógenas, que se muestran interferentes al sobrepasar una concentración tolerable en procedimientos de detección fotométricos, y pueden provocar un fallo sistemático. Como es sabido, muestras de plasma hemolíticas, ictéricas y/o lipémicas, las denominadas muestras HIL, que disponen de concentraciones de hemoglobina, bilirrubina y/o triglicérido anómalamente elevadas, ocasionan problemas. Concentraciones anómalamente elevadas de estas substancias interferentes se pueden ocasionar mediante un estado patológico del paciente, o bien mediante una obtención o almacenaje de muestra inapropiados.

Por consiguiente, la presente invención tomaba como base la tarea de poner a disposición un procedimiento para la determinación de factor XIII, que fuera menos propenso a averías frente a substancias interferentes intrínsecas de la muestra. En especial existía la tarea deponer a disposición un procedimiento que posibilitara la determinación de factor XIII en muestras con concentraciones elevadas de hemoglobina, bilirrubina y/o triglicérido.

La tarea se soluciona modificándose un procedimiento conocido para la determinación de factor XIII, en el que a) la muestra se mezcla con I. una substancia para la activación del factor XIII para dar el factor XIIIa (por ejemplo con trombina en presencia de iones Ca2+) , II. con un substrato aceptor para factor XIIIa (por ejemplo con un péptido que contiene glutamina) , III. con un substrato donador de grupos amino para factor XIIIa (por ejemplo con una amina primaria) , IV. con NADH o NADPH, y V. con un agente que, en presencia de amoniaco, puede oxidar NADH para dar NAD+ (por ejemplo constituido por glutamato-dehidrogenasa y a-cetoglutarato) , y

b) se mide la modificación de la absorción de la carga de ensayo,

de modo que en lugar de NADH o NADPH se emplea un análogo de NADH o NADPH, un denominado análogo de NAD (P) H, que presenta un máximo de absorción, que se sitúa por encima de 350 nm, siendo el análogo de NAD

(P) H tio-NAD (P) H o seleno-NAD (P) H.

Para la simplificación se emplea el término NAD (P) H, si las explicaciones se refieren tanto a la forma fosforilada, como también a la forma no fosforilada de NADH, es decir, si con NADH y NADPH nos referimos a lo mismo. El término NAD (P) + se emplea si las explicaciones se refieren tanto a la forma fosforilada, como también a la forma no fosforilada de NADH en estado oxidado, es decir, si con NAD+ y NADP+... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la determinación de factor XIII en una muestra, en el que a) la muestra se combina con uno o varios reactivos que contienen I. una substancia o una mezcla de substancias para la activación del factor XIII para dar el factor 5 XIIIa,

II. un substrato aceptor para factor XIIIa con al menos un grupo glutaminilo,

III. un substrato donador de grupos amino para factor XIIIa,

IV. un análogo de NAD (P) H con un máximo de absorción que se sitúa por encima de 350 nm, y

V. un agente que, en presencia de amoniaco, es capaz de oxidar NAD (P) H para dar NAD (P) + o 10 un análogo de NAD (P) H para dar el correspondiente análogo de NAD (P) +,

y

b) se mide la modificación de la absorción de la carga de ensayo, y siendo el análogo de NAD (P) H tio-NAD (P) H o seleno-NAD (P) H.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, mezclándose además la muestra con un inhibidor de agregación de 15 fibrina en el paso a) .

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, siendo trombina la substancia para la activación del factor XIII para dar factor XIIIa.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, siendo el substrato aceptor para factor XIIIa con al menos un grupo glutaminilo un polipéptido que presenta al menos un resto glutamina como aceptor de amina.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, siendo el substrato donador de grupos amino para factor XIIIa una amina primaria, preferentemente una amina primaria del grupo etanolamina, putrescina, cadaverina, diaminoetano, aminoetano, glicinetiléster y glicinmetiléster.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo el agente que, en presencia de amoniaco, es capaz de oxidar NAD (P) H para dar NAD (P) + o un análogo de NAD (P) H para dar el

correspondiente análogo de NAD (P) + un enzima y un substrato para el enzima.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, siendo el enzima glutamatodehidrogenasa y el substrato para el enzima a-cetoglutarato.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, mezclándose la muestra además con una substancia neutralizante de heparina en el paso a) , preferentemente con bromuro de hexadimetrina, y/o con cloruro de calcio.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, midiéndose la modificación de la absorción de la carga de ensayo con luz de una longitud de onda de aproximadamente 340 nm a aproximadamente 430 nm, preferentemente con luz de una longitud de onda de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 420 nm, de modo muy especialmente preferente con luz de una longitud de onda de aproximadamente 390 a aproximadamente 410 nm.

10. Empleo del análogo de NAD (P) H tio-NAD (P) H en un procedimiento para la determinación de factor XIII en una muestra.

11. Empleo del análogo de NAD (P) H seleno-NAD (P) H en un procedimiento para la determinación de factor XIII en una muestra.

12. Kit de ensayo para la puesta en práctica de un procedimiento para la determinación de factor XIII en una muestra, comprendiendo el kit de ensayo los siguientes componentes:

a. un primer reactivo que contiene una substancia o una mezcla de substancias para la activación del factor XIII para dar el factor XIIIa, preferentemente trombina;

b. un segundo reactivo que contiene

* al menos un substrato aceptor con al menos un grupo glutaminilo para factor XIIIa, 5 * al menos un substrato donador de grupos amino para factor XIIIa, preferentemente una amina primaria, y

* al menos un agente que, en presencia de amoniaco, es capaz de oxidar NAD (P) H para dar NAD (P) + o un análogo de NAD (P) H para dar el correspondiente análogo de NAD (P) +, estando constituido el agente preferentemente por glutamato-dehidrogenasa y a-cetoglutarato; y

c. un tercer reactivo que contiene al menos un análogo de NAD (P) H con un máximo de absorción que se 10 sitúa por encima de 350 nm, y siendo el análogo de NAD (P) H tio-NAD (P) H o seleno-NAD (P) H.

13. Kit de ensayo según la reivindicación 12, conteniendo el primer reactivo trombina para la activación del factor XIII para dar factor XIIIa, y adicionalmente cloruro de calcio y/o inhibidor de agregación de fibrina y/o bromuro de hexadimetrina.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4