Procedimiento para la calibración de un elemento sensor.
Procedimiento para la calibración de un elemento sensor que presenta un oligonucleótido de sondeo inmovilizado,
a través del cual se puede captar mediante el sensor el enlace de un ácido nucleico diana (Z), que incluye:
a) Puesta en contacto del elemento sensor con una mezcla que contiene ácido nucleico de control (K) y ácidonucleico diana (Z), donde la temperatura de fusión del ácido nucleico de fusión Tm(K) es menor a la temperatura defusión del ácido nucleico diana Tm(Z), donde Tm (K) es la temperatura por debajo de la cual el ácido nucleico decontrol (K) se hibrida con el oligonucleótido de sondeo inmovilizado y donde Tm (Z) es la temperatura por debajo dela cual el ácido nucleico diana (Z) se hibrida con el oligonucleótido de sondeo inmovilizado;
b1) hibridación de la mezcla con el oligonucleótido de sondeo en una temperatura T[p]< Tm(K) y detección de unaseñal de control positiva;
b2) modificación de las condiciones de astringencia en una temperatura de medición T≥T[mess], de manera que:Tm ( K )< T [ mess ]< Tm ( Z ),
y detección de una señal de medición; y
c) modificación de las condiciones de astringencia, de manera que T[n] >Tm(Z) y detección de una señal de controlnegativa.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/064680.
Solicitante: SIEMENS AKTIENGESELLSCHAFT.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: WITTELSBACHERPLATZ 2 80333 MUNCHEN ALEMANIA.
Inventor/es: GUMBRECHT, WALTER, DR., STANZEL,MANFRED,DR, PAULICKA,Peter, FRIEDRICH,KATJA, WEBER,RENEE.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
PDF original: ES-2396934_T3.pdf
![Procedimiento para la calibración de un elemento sensor.](https://patentados.com/img/2013/03/1234780/procedimiento-calibracion-elemento-sensor.jpg)
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para la calibración de un elemento sensor
La presente invención hace referencia a un procedimiento, así como a una configuración, para la calibración de elementos sensores, sobre todo para la calibración de elementos sensores en configuraciones de micromatrices.
En la analítica de ácidos nucleicos, el desarrollo de métodos basados en micromatrices ha alcanzado avances importantes en los últimos años. Una configuración de micromatrices es una configuración de una matriz de moléculas de sondeo, las cuales se colocan en un sensor, en posiciones individuales que se pueden direccionar, de manera que cada posición en la configuración de matrices forma un elemento sensor con el cual se puede detectar una molécula diana. En la analítica de ácidos nucleicos por lo general se utilizan oligonucleótidos de sondeo como moléculas de sondeo, las cuales, por ejemplo en una configuración en forma de chip, son inmovilizadas (“sustraídas”) en una matriz en forma de trama sobre un soporte. Mediante hibridación con un ácido nucleico diana complementario se produce el enlace con el oligonucleótido de sondeo. Este enlace se puede detectar luego mediante varios procedimientos alternativos, de forma que debido al suceso de enlace se puede captar la presencia del ácido nucleico diana (Z) y, dado el caso, también cuantificarla. Como métodos de prueba se utilizan procedimientos ópticos, electroquímicos, magnéticos y otros que sean adecuados.
En el caso de los procedimientos ópticos, el ácido nucleico diana o el híbrido de ácido nucleico diana y oligonucleótido de sondeo se marcan por medio de un marcador lo que conlleva una señal detectable ópticamente. Esto puede ser un colorante, un fluoróforo, un cromóforo, un colorante intercalante, un colorante fluorescente o similar. Al generarse un suceso de enlace, en la posición direccionable del respectivo oligonucleótido de sondeo se puede captar una señal que se puede detectar ópticamente, por ejemplo por una cámara CCD, que puede representar toda la matriz.
En el procedimiento de comprobación electroquímico, los oligonucleótidos de sondeo pueden ser inmovilizados sobre un sensor electroquímico. El ácido nucleico diana o el híbrido de oligonucleótido de sondeo y ácido nucleico diana se marcan con un marcador, el cual modificará localmente las características electroquímicas en el elemento sensor en la posición del respectivo oligonucleótido, de manera tal que se pueda medir una señal eléctrica, por ejemplo una tensión, un flujo de corriente, un cambio capacitancia o similar. Un procedimiento como este es conocido por la solicitud DE 101 26 341. En dicho procedimiento, el ácido nucleico diana se marca con biotina. Luego de la hibridación del ácido nucleico diana y el oligonucleótido de sondeo, el ácido nucleico diana enlazado se marca con fosfatasa estreptavidina-alcalina y se le ofrece a la fosfatasa alcalina un sustrato enzimático, el cual en la conversión por medio de la fosfatasa genera un producto que modifica localmente la conductividad, de manera que entre los electrodos sobre los que se encuentra inmovilizado el oligonucleótido de sondeo se puede medir un aumento de corriente local.
En el procedimiento gravimétrico se detecta una señal, la cual se genera mediante la modificación de la masa durante la hibridación del ácido nucleico diana y el oligonucleótido de sondeo. Se conocen, por ejemplo, el procedimiento FBAR y el procedimiento Kantilever.
En una detección magnética, el oligonucleótido de sondeo es inmovilizado sobre un elemento sensor magnético, por ejemplo un sensor GMR. El ácido nucleico diana o el híbrido del oligonucleótido de sondeo y el ácido nucleico diana puede ser marcado, por ejemplo, con partículas paramagnéticas, por ejemplo nanopartículas de óxido de hierro, de manera que en la posición del oligonucleótido, durante el enlace del ácido nucleico diana, se puede detectar una modificación de las características magnéticas.
Un problema que surge en todos los principios de detección se basa en el hecho de que entre los elementos sensores individuales pueden surgir diferencias cualitativas, que justamente en procedimientos de medición altamente sensitivos y cuantitativos o semi-cuantitativos pueden conducir a potencias de señal de diferentes intensidades. También mediante otras influencias exteriores, por ejemplo variaciones o gradientes en la temperatura o variaciones de temperatura o corriente determinadas por la fluídica en la superficie sensora, puede suceder que no todos los elementos sensores en una configuración de micromatrices presenten la misma sensibilidad, o que habiendo la misma concentración del ácido nucleico diana (z) no envíen la señal con la misma intensidad de señal. Se sabe, por ejemplo, que los elementos sensores que se encuentran en el margen de una configuración de micromatrices se comportan de manera diferente a los elementos sensores que se encuentran en la zona media de una configuración de micromatrices.
Para un funcionamiento fiable, libre de errores, de análisis basados en micromatrices es necesario, por lo tanto, uncontrol de calidad que también sea fiable y libre de errores. Éste debe contener especialmente todos los elementos básicos de un control positivo y negativo. Para esto, un elemento sensor correspondiente debe ser calibrado, en caso ideal, mediante una calibración de dos puntos, es decir que cada sensor debe ser cargado no solo con la
muestra que se debe determinar, sino también con dos muestras conocidas (concentraciones) y las respectivas señales de medición deben ser registradas.
Sobre todo para los sistemas de micromatrices con una gran cantidad de elementos sensores o posiciones direccionables, este modo de proceder es muy difícil de llevar a la práctica, ya que un sistema de calibración de dos puntos por lo general requiere medidas complejas y muy costosas. En la técnica se suele solucionar y eludir este problema previendo diferentes posiciones de elementos sensores como elementos sensores de control (puntos de control) en la configuración de micromatrices. Sin embargo, lo mencionado tiene la desventaja de que se debe suponer que los diferentes sensores se comportan de manera absolutamente idéntica y que los puntos de control previstos sean representativos para todos los elementos sensores.
La solicitud WO 2005/064012 publica un sistema de matrices con campos de medición y campos de control separados, donde en los campos de control hay otras moléculas captadoras aparte de las presentes en los campos de medición. La solicitud 2006/115851 A1 publica un procedimiento para la utilización de controles como calibradores para el sistema de micromatrices donde determinadas cantidades de controles se suministran al sistema bajo condiciones de hibridación y donde éstos enlazan de manera inespecífica con moléculas captadoras.
El objeto de la presente invención consiste en la realización de una calibración de dos puntos simple y económica que pueda realizarse con un mismo elemento sensor, el cual también se utiliza como sensor para un ácido nucleico diana. Acorde a la invención, este objetivo se logra mediante el procedimiento conforme a la reivindicación 1. Desarrollos ventajosos de la invención se describen en las reivindicaciones secundarias.
La presente invención hace referencia a un procedimiento para la calibración de un elemento sensor acorde a la reivindicación 1, que presenta:
a) Puesta en contacto del elemento sensor con una mezcla que contiene ácido nucleico de control (K) y ácido nucleico diana (Z) , donde la temperatura de fusión del ácido nucleico de fusión Tm (K) es menor a la temperatura de fusión del ácido nucleico diana Tm (Z) , donde Tm (K) es la temperatura por debajo de la cual el ácido nucleico de control (K) se hibrida con el oligonucleótido de sondeo inmovilizado y donde Tm (Z) es la temperatura por debajo de la cual el ácido nucleico diana (Z) se hibrida con el oligonucleótido de sondeo inmovilizado;
b1) hibridación de la mezcla con el oligonucleótido de sondeo en una temperatura T[p] < Tm (K) y detección de una señal de control positiva;
b2) modificación de las condiciones de astringencia en T=T[mess], de manera que:
Tm ( K ) < T [ mess] < Tm ( Z ) ,
y detección de una señal de medición; y, de manera opcional
c) modificación de las condiciones de astringencia, de manera que T[n] > Tm (Z) y detección de una señal de control negativa.
Tm (K) es la temperatura de fusión del ácido nucleico de control en las condiciones del disolvente preestablecidas.
Tm (Z) es la temperatura de fusión del ácido nucleico diana en las condiciones del disolvente preestablecidas.... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para la calibración de un elemento sensor que presenta un oligonucleótido de sondeo inmovilizado, a través del cual se puede captar mediante el sensor el enlace de un ácido nucleico diana (Z) , que incluye:
a) Puesta en contacto del elemento sensor con una mezcla que contiene ácido nucleico de control (K) y ácido nucleico diana (Z) , donde la temperatura de fusión del ácido nucleico de fusión Tm (K) es menor a la temperatura de fusión del ácido nucleico diana Tm (Z) , donde Tm (K) es la temperatura por debajo de la cual el ácido nucleico de control (K) se hibrida con el oligonucleótido de sondeo inmovilizado y donde Tm (Z) es la temperatura por debajo de la cual el ácido nucleico diana (Z) se hibrida con el oligonucleótido de sondeo inmovilizado;
b1) hibridación de la mezcla con el oligonucleótido de sondeo en una temperatura T[p] < Tm (K) y detección de una señal de control positiva;
b2) modificación de las condiciones de astringencia en una temperatura de medición T=T[mess], de manera que:
Tm ( K ) < T
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