Inmunoanálisis de hidrato de cloral.

Un inmunOgeno de la estructura **Fórmula**

donde α ≥

0 ó 1 y donde, cuando n ≥ I, el agente de reficulación se une el sustituyente carbonilo del

anillo de tetrahidropirano al accm, el material portador que confiere antigenicidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La detección y cuantificación analitica de drogas psicoactivas, drogas terapéuticas. residuos de fármacos veterinarios y contaminantes ambientales, tales como pesticidas y sustancias químicas industriales,

constituyen una práctica comercial importante y generalizada, y se puede llevar a cabo en el laboratorio o sobre el terreno. El equipo analftico utilizado en el laboratorio y en el terreno puede ser el mismo. pero los métodos en el terreno están generalmente más limitados debido al tamai\o y a la capacidad de análisis.

Por ejemplo, a pesar de que se han eloborado formatos portátiles, los métodos anallticos más comúnmente utilizados para una cuantificación precisa son la cromatografia de gases (00) y la cromatografía líquida (eL) , a menudo vinculadas a los espectr6metros de masas (lo que da GC-MS y

LCMS por sus siglas en inglés, respectivamente) y su utilización se restringe a un entorno de laboratorio. Las principales alternativas a los métodos cromatográficos se basan en la interacción de moléculas a través de reacciones qulmicas o de fonnación de complejos químicos, estando esta última caracterizada po.r la unión del anticuerpo-ligando_ Las principales ventajas de estos métodos químicos ''vinculantes'', en comparación con los métodos cromatográficos, son su relativo bajo coste y su sencillez

y portabiJidad, lo que permite su utiUzación sobre el terreno.

El hidrato de cloral 2, 2, 2-tricloroetanediol se utiliza como sedante en el proceso de anestesia y como precursor químico en química orgánica sintética. Su utilización para combatir el insomnio puede conducir a la adicción y a la sobredosis (OauJlier y col. 2001; Engelhart y col. 1998) . La sobredosis de hidrato de cloral se detecta a menudo mediante la reacción de Fujiwara, que detecta el metabolito 2, 2, 2tricloroetanoJ, seguido por la cuantificación mediante GC-MS. Sus pt"opiedades sedantes han sido explotadas para su uso ilegal: esta sustancia. mezclada con alcohol, produce las famosas "gotas noqueadoras" o "Míckey Finn", inslpidas e inodoras e históricamente conocidas por su utilización para cometer robos con mayor facilidad. En cualquier debate o análisis sobre la violación por sumisión química (DFR, por sus siglas en inglés) por lo general se menciona el hidrato de cloral. Sin embargo. la prueba definitiva de su uso en la DFR es por lo general poco eficiente, lo que implica o bien que dicho uso es poco frecuente, o que ex.isten problemas para detectar esta sustancia. El hidrato de cloral se metaboliza rápidamente (Breimer 1974) y los principales metabolitos son tricloroetanol, tricJoroelanol glucurónido (rOC) y ácido tricloroacético, con sus respectivas vidas medias de 7-10 horas, 7-10 horas y aproximadamente 4 dias (pbannGKB: The Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base. Chleral Hydrate, Accession 1D:PA448925) . En las veinticuatro horas posteriores a la administra<:ión de una dosis via oral única de hidrato de cloral, aproximadamente el 0, 7 % se excreta en la orina como tricloroetanol y el 28 % como TOC. (Eliminación de drogas y sustancias qulmicas tóxicas en el hombre, octava edición [original inglés: Disposition ofToxic Drugs and Chemicals in Man, eighth edition}) . Los métodos analfticos para detectar y cuantificar los metabolitos de hidrato de cloral incluyen una CG equipada CQn un detector ECO (Breimer 1977; Ikedo y col. 1984) y la reacción Fujiwara más CG-EM (HeJler y col. 1992) .

El hidrato de cloral es un producto derivado de los productos de desinfección (DBP por sus siglas en inglés) que se utilizan en la c10ración industrial dc~1 agua. atribuido a la reacción del cloro con la materia orgánicu trazo. como el ácido húmico, y ha sido clasificado como un posible carcinógeno humano por la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. (EPA) y Health Canada. La EPA de EE. Uu. ha aprobado un método que utiliza cromatografia de gases y detección de captura de electrones (CG-DCE) para su cuantificación y Health Canada sugiere una ingesta diaria tolerable (lDl) de 0.3 mg al dla para una persona común (Health Canada, Orientación sobre hidrato de cloral en el agua potable) . Los niveles en el agua potable se han calculado en una cifra que oscila entre 1, 2 y 8, 4 ng/ml (máximo 23 ng/ml) en Canadá y entre 1.7 y 2.5 ng/ml (máximo 46 ngIml) en Estados Unidos. El tricloroetileno es un disolvente industrial muy utilizado en la limpieza y el desengrasado del metal y la exposición humana a esta sustancia qulmica puede producirse a través del aire contaminado, el agua potable o los alimentos. Tras su inhalación o ingestión, la sustancia química se metaboliza rápidamente a través de dos rutas: la conjugación con glutatión, que es la ruta menor, y la oxidación por las enzimas del citocromo P450, que es la no principal. La ruta principal de oxidación produce el ep6xido, que se transforma rápidamente en hidrato de cloral o cloral, seguido por la slntesis de tricloroetanol, Y. finalmente, la formación de glucurónido tricloroetanol (L.H. Lash Y col. 2000) . El glucurónido se encuentra en la orina de los seres humanos u utros mamlferos Que se han visto I~XpUestoS al tricloroetileno, o a los que se les ha administrado tricloroetileno (Lash y col. 2000 20; Stenner y col. 1997, Kim y Ghanayem 2006) y se ha relacionado con las enfermedades autoinmunes.

Por lo tanto, la disposición de un ensayo que se base en anticuerpos para esbJdiar un caso de violación en la que se ha utilizado hidrato de cloral, un exceso dc eloro en el agua y la sospecha de exposición al tricioroetileno. constituirlan una alternativa rápida y barata frente a los métodos actuales para detectar la sustancia. Por otra parte, un dispositivo lisio para utilizar, como una varilla de medición, permitirla a las personas o agencias de vigilancia del medio ambiente detectar el hidrato de cloral. cloro y tricloroetileno de forma indirecta mediante la medición de Te (; en muestras de orina. En la actualidad no existen inmunoanálisis conocidos para el hidrato de d oral o :rus mctabolitos, tricloroetallol, glucurónido tricloroetanol y ácido tricloroacélico.

Bibliografia Breimer D.n. (1977) . Clin. Phannacokin., 2: 93-109 Engelhart O.A. y col. (1998) J. Anal. Taricol .• 22: 246-247 GaullierJ.M. y col. (2001) . J. Forensic Sei., 46: 1507-1509 Heller P. y col. (1992) . Forens. &i. Inl., 52:231-234 LashycoI.1984) .J. Chromatogr., 307: 111-119 Lash Y col. 2 (00) Em. Heollh Perspectives, 108: 177-200 Stcnner el al (1997) . Drug Metab. Dispas., 25: 529-535; Kim D. y Ghanayem B. (2006) . Dmg Me/ab. Dispos" 34: 2020-2027

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN El presente documento describe el primer irununoanáJisis conocido que confinna de forma indirecta la presencia o el uso de hidrato de cloral. Debido al rápido metabolismo del hidrato de cloral, los inventores desarrollaron. mediante nuevos inmun6genos y un, nuevo anticuerpo, un inmunoanálisis sustituto para su detección y cuantificación que se enfoca en el metabolito TeG. El anticuerpo de la inverlCión es sorprendentemente especIfico para TeO. El uso de un anticuerpo específico TCG en un contexto de un inmunoanálisis resuelve las limitaciones de recursos y prácticas asociadas a los ~todos analíticos descrllos anterionnente y que se utilizan para dl::tectar el hidrato de cloral y sus metabolitos, lo que permite su aplicación en diversas áreas como la OFR, análisis del agua y toxicologfa ambiental.

DIBUJOS

Ilustración I Preparación de Hapteno A Uultración l Preparación de Hapteno B nusfradón 3 Antigeno 11 Ilustración 4 Hidrato de cloral y metabolitos EXPOSICiÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la invención es un antlgeno de la estructura (estructura. 1)

o Estructura 1

donde n "'O o l . Donde n ". l. el agente de retjculación se une al carbonilo sustituyente del anillo de tetrahidropirano al acem (siglas en inglés) , un material transportador que confiere antigenicidad. El agente de reliculación es un grupo que une el hapteno al acem. El hapleno de la presente invención es la fracción de triclorometilpirano de la Estructura 1 que está unida bien al reticulante o al accm. El agente 5 de reticulación, es preferiblemente -X-Y-z.., dClnde X es un heteroátomo, preferiblemente nitrógeno, oxigeno o azufre; Y es un CI, CIO, preferiblemente un C2-Ct. fracción de cadena lineal de a1quileno, o fracción de alquileno; Z (antes de la coI\iuga.ción con el accm) se selecciona de un carboxi, un ditiopiridilo, una maleimida. un amina, un hidrOldlo, un tiol, un tioéster o una fracción de a1dehído. más preferiblemente una fracción de carboxi. Un antlgeno preferido es donde n -O, es decir un arrtlgenoen en el que el TeG está unido directamente al acern. Un antlgeno preferido... [Seguir leyendo]

l. Un inmunógeno de la estructura el o OH

donde n = o o I y donde, cuando n = 1, el agente de reticulación se lUle el sustituyente carbonilo del

anillo de tetrahidropirano al accm, el malerial portador que confiere antigenicidad.

2. El agente de reticulación es preferiblemente ~X~Y-Z-. donde X es un hcteroluomo, preferiblemente nitrógeno, oxigeno o azufre; Y es un C, -C, o. preferiblemente un Cl-C., fracción de cadena lineal de alquileno. o fracción de alquileno; Z (antes de la conjugación con el accm) se selecciona de carbolci, ditiopiridilo, maleímida. emino, hidroxilo, liol, tioéster o una fracción de aldehído, más preferiblemente una fracción de aldehido.

J. El inmunógeno de la Reivindicación I en la que n ""' O Y el atx:m es tiroglobul ina bovina (Inmunógeno 11) .

4. Un anticuerpo que se une especlficamenw a un epllopo de glucurónido tricloroetanol se caracteriza, además, por ser producido contra un inmunógeno de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

S. Un método para detectar la ¡ngesta de hidrato de cloral; el método consiste en poner en contacto una muestra in vitro lomada de la persolli'l con un conjugado y el anticuerpo de cualquiera de la Reivindicación 4, detectando el conjugado unido y deduciendo a partir de los valores del calibrador

la presencia o cantidad de TeG.

6. Otro aspecto de la invención es un método para detectar y cuantificar el TCG en una persona o solución es el método que consiste en poner en contacto una muestra in vilro. tomada de la pc:rsonao una solución con un conjugado, y el anticuerpo de la Reivindicación 4, detectando el conjugado unido y deduciendo a partir de los valores del calibrador la presencia o cantidad de TCG.

7. El mélOdo de las Reivindicaciones S o 6 en el que una muestra in vitro eS orina.

8. Un kit que incluye el anticuerpo de la Reivindicación 4 y un cOfljUgadO cllpude fijarse al 15 anticuerpo.