Glucanasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para eleborarlas y utilizarlas.

Un ácido nucleico, sintético o recombinante, aislado que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99%, o más o completa (100%) de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 37, donde el ácido nucleicocodifica al menos un polipéptido que tiene: (i) una actividad glucanasa, o (ii) actividad inmunogénica y puedegenerar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia como la mostradaen el SEQ ID NO: 38;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la mostrada enel SEQ ID NO: 38;

(c) una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones restrictivas con el complemento de un ácidonucleico que comprende el SEQ ID NO: 37;

en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad glucanasa, y las condicionesrestrictivas incluyen una etapa de lavado que comprende un lavado a 0,2x SSC a una temperatura de 65ºCdurante 15 minutos; o

(d) un ácido nucleico complementario al ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c).

Glucanasas, Ácidos Nucleicos que las codifican y métodos para elaborarlas y utilizarlas

Referencia Cruzada a la Lista de Secuencias Presentada en un Disco Compacto Esta solicitud incluye un disco compacto (presentado por cuadruplicado) que contiene una lista de secuencias. El contenido completo de la lista de secuencias se incorpora a la presente en su totalidad como referencia. Esta lista de secuencias se identifica en el disco compacto como sigue.

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Listing.txt 2 de Julio de 2004 1.562.624

Campo de la Invención Esta invención se refiere generalmente a enzimas, polinucleótidos que codifican las enzimas, al uso de tales polinucleótidos y polipéptidos y más específicamente a polipéptidos (p. ej., enzimas, anticuerpos) que tienen una actividad glucanasa, p. ej., endoglucanasa, p. ej. que cataliza la hidrólisis de enlaces endo-º-1, 4- y/o º-1, 3glucanasa internos. En un aspecto la actividad endoglucanasa (p. ej., actividad endo-1, 4-beta-D-glucan 4-glucano hidrolasa) que comprende la hidrólisis de los enlaces beta-D-glicosídicos 1, 4- y/o º-1, 3- en la celulosa, los derivados de celulosa (p. ej., carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa) , liquenina, enlaces beta-1, 4- en glucanos beta-1, 3mixtos, tales como beta-D-glucanos y/o xiloglucanos de cereales y otro material vegetal u orgánico que contenga porciones celulósicas.

Antecedentes Las endoglucanasas (p. ej., endo-beta-1, 4-glucanasas, EC 3.2.1.4; endo-beta-1, 3 (1) -glucanasas, EC 3.2.1.6; endobeta-1, 3-glucanasas, EC 3.2.1.39) hidrolizan enlaces º-1, 4- y/o º-1, 3-glucosídicos en celulosa y glucano para producir glucosa y oligómeros de glucosa de peso molecular más bajo. Los glucanos son polisacáridos formados a partir de D-glucopiranosa unida por 1, 4-º-y/o 1, 3-glicósido. Las endoglucanasas tienen un valor comercial considerable, utilizándose en la industria alimentaria, para panificación y tratamiento de frutas y vegetales, descomposición de residuos agrícolas, en la fabricación de piensos para animales (p. ej., piensos para pollos) , en la producción de pasta de papel y papel, en manufactura textil y productos de limpieza domésticos e industriales. Las endoglucanasas son producidas por hongos y bacterias.

Los beta-glucanos son los polisacáridos principales de los cereales aparte del almidón. El contenido en glucanos puede variar significativamente dependiendo de la variedad y de las condiciones de crecimiento. Las propiedades fisicoquímicas de este polisacárido son tales son tales que éste da lugar a soluciones viscosas o incluso geles en condiciones oxidativas. Además, los glucanos tienen una alta capacidad de unirse a agua. Todas estas características presentan problemas para varias industrias incluyendo la elaboración de cerveza, panificación, nutrición animal. En las aplicaciones para la elaboración de cerveza, la presencia de glucano da como resultado problemas en la filtrabilidad de la malta y la formación de turbidez. En las aplicaciones para panificación (especialmente para galletas y galletas saladas) , los glucanos pueden crear masas pegajosas que son difíciles de trabajar y reducen el tamaño de la galleta. Además, este carbohidrato está implicado en la rehidratación rápida del producto horneado dando como resultado la pérdida del carácter crujiente y la reducción de su vida útil. Para aplicaciones de alimentación de animales monogástricos con dietas de cereales, el beta-glucano es el factor que más contribuye a la viscosidad del contenido de los intestinos y por lo tanto afecta adversamente a la digestibilidad del alimento y al ritmo de crecimiento del animal. Para animales rumiantes, estos beta-glucanos representan componentes sustanciales de la ingesta de fibra y la digestión más completa de los glucanos facilitaría eficiencias de conversión de alimentos superiores. Para las endo-glucanasas para alimentación animal es deseable que sean activas en el estómago del animal.

Las endoglucanasas también son importantes para la digestión de la celulosa, un glucano unido por beta-1, 4encontrado en todo el material vegetal. La celulosa es el polisacárido más abundante en la naturaleza. Las enzimas comerciales que digieren la celulosa tienen utilidad en la industria de la pasta de papel y el papel, en la manufactura textil y en productos de limpieza domésticos e industriales.

Las publicaciones comentadas en la presente memoria se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente memoria debe ser considerado como una admisión de que la invención no está titulada antes de tal descripción en virtud de la invención anterior.

Compendio de la Invención Las características de la invención se presentan en las reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, o una identidad de secuencia completa (100%) con el SEQ ID NO: 37, donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene (i) una actividad glucanasa, p.ej., endoglucanasa, (ii) una actividad inmunogénica y puede generar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 38. Las identidades de secuencia se determinan por medio del análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por medio de inspección visual.

Los ácidos nucleicos ilustrativos de la invención también incluyen ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que codifican un polipéptido de la invención que tiene una secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 38.

La invención proporciona ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones restrictivas con el complemento de un ácido nucleico que comprende el SEQ ID NO: 37, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad glucanasa, y las condiciones restrictivas incluyen una etapa de lavado que comprende un lavado en 0, 2X SSC a una temperatura de 65°C durante 15 minutos.

Asimismo se proporcionan ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden un ácido nucleico complementario a cualquiera de los ácidos nucleicos anteriormente mencionados de la invención.

En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad glucanasa, p. ej., endoglucanasa, que cataliza la hidrólisis de enlaces endo-º-1, 4- y/o 1, 3-glucanasa internos.

En un aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2 donde una configuración de filtrado se ajusta a blastall –p blastp –d "nr pataa" -F F, y todas las demás opciones se ajustan por defecto.

Otro aspecto de la invención es una sonda para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad glucanasa, donde la sonda puede comprender al menos 10 bases consecutivas, o al menos de 10 a 50, de 20 a 60, de 30 a 70, de 40 a 80, de 60 a 100, o de 50 a 150 bases consecutivas, de una secuencia que comprende (a) el SEQ ID NO: 37, o (b) una secuencia de la invención, donde la sonda identifica el ácido nucleico mediante unión o hibridación. La sonda puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente de 10 a 50, aproximadamente 20 a 60, aproximadamente 30 a 70, aproximadamente 40 a 80, aproximadamente 60 a 100, bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma.

En un aspecto, la actividad glucanasa de la invención comprende una actividad endoglucanasa, p. ej., una actividad endo-1, 4-beta-D-glucan 4-glucano hidrolasa) . En un aspecto, la actividad endoglucanasa comprende catalizar la hidrólisis de los enlaces 1, 4-beta-D-glicosídicos. En un aspecto, la actividad glucanasa, p. ej., endoglucanasa, comprende una actividad endo-1, 4- y/o 1, 3-beta-endoglucanasa o una actividad endo-º-1, 4-glucanasa. En un aspecto, la actividad glucanasa (p. ej., actividad endo-1, 4-beta-D-glucan 4-glucano hidrolasa) comprende la hidrólisis de los enlaces 1, 4-beta-D-glicosídicos en la celulosa, los derivados de celulosa (p. ej., carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa) , liquenina, enlaces beta-1, 4- en glucanos beta-1, 3-mixtos, tales como beta-D-glucanos de cereales y otro material vegetal que contenga porciones celulósicas.

En un aspecto, la actividad glucanasa comprende hidrolizar un glucano u otro polisacárido para producir un polisacárido u oligómero de peso molecular más bajo. En un aspecto, el glucano comprende un beta-glucano, tal... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico, sintético o recombinante, aislado que comprende:

(a) una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más o completa (100%) de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 37, donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene: (i) una actividad glucanasa, o (ii) actividad inmunogénica y puede generar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia como la mostrada en el SEQ ID NO: 38;

(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la mostrada en el SEQ ID NO: 38;

(c) una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones restrictivas con el complemento de un ácido nucleico que comprende el SEQ ID NO: 37; en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad glucanasa, y las condiciones restrictivas incluyen una etapa de lavado que comprende un lavado a 0, 2x SSC a una temperatura de 65ºC durante 15 minutos; o

(d) un ácido nucleico complementario al ácido nucleico de cualquiera de (a) a (c) ;

2. Una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad glucanasa, donde la sonda comprende al menos 10 bases consecutivas, o al menos de 10 a 50, 20 a 60, 30 a 70, 40 a 80, 60 a 100, o 50 a 150 bases consecutivas, de una secuencia que comprende (a) el SEQ ID NO: 37, o (b) la secuencia de la reivindicación 1, en donde la sonda identifica el ácido nucleico mediante unión o hibridación.

3. Un casete de expresión, un vector o un vehículo de clonación que comprende un ácido nucleico que comprende la secuencia de la reivindicación 1, en donde el vehículo de clonación comprende opcionalmente un vector viral que comprende un vector de adenovirus, un vector retroviral o un vector viral adenoasociado, o en donde el vehículo de clonación comprende opcionalmente un cromosoma artificial bacteriano (SAC) , un plásmido, un vector derivado del bacteriófago P1 (PAC) , un cromosoma artificial de levadura (YAC) , o un cromosoma artificial de mamífero (MAC) ;

4. Una célula transformada que comprende (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de la reivindicación 1;

o (b) el casete de expresión, vector o vehículo de clonación de la reivindicación 3, en donde opcionalmente, la célula transformada es una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula vegetal.

5. Un animal no humano, planta, parte de planta o semilla vegetal transgénicos que comprenden (a) la secuencia de la reivindicación 1, o el casete de expresión, vector o vehículo de clonación de la reivindicación 3; o (b) el animal no humano transgénico de (a) , en donde el animal es un ratón.

6. Un polipéptido, sintético o recombinante, aislado que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,

o más o completa (100%) de identidad de secuencia con el SEQ ID NO: 38, en donde el polipéptido tiene: (i) una actividad glucanasa, o (ii) actividad inmunogénica y puede generar un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia como la mostrada en el SEQ ID NO: 38;

(ii) una secuencia de ácido nucleico codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1;

(iii) la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y que tiene al menos una sustitución de residuo de aminoácido conservativa y conserva una actividad glucanasa, en donde una sustitución conservativa comprende la sustitución de un residuo de aminoácido por otro aminoácido de características similares;

(iv) la secuencia de aminoácidos de (iii) , en donde la sustitución conservativa comprende el remplazo de un aminoácido alifático por otro aminoácido alifático; o, el remplazo de una Serina por una Treonina o viceversa; o, el remplazo de un residuo ácido por otro residuo ácido; o, el remplazo de un residuo que porta un grupo amida por otro residuo que porta un grupo amida; o, el intercambio de un residuo alcalino por otro residuo alcalino; o, el remplazo de un residuo aromático por otro residuo aromático, o una combinación de los mismos;

(v) la secuencia de aminoácidos de (iv) , en donde el residuo alifático comprende Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina o un equivalente sintético de los mismos; o, el residuo ácido comprende Ácido aspártico, Ácido glutámico o un equivalente sintético de los mismos; o, el residuo que comprende un grupo amida comprende Ácido aspártico, Ácido glutámico o un equivalente sintético de los mismos; o, el residuo alcalino comprende Lisina, Arginina, o un equivalente sintético de los mismos; o, el residuo aromático comprende Fenilalanina, Tirosina o un equivalente sintético de los mismos;

(vi) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (i) a (v) , en donde el polipéptido carece de una secuencia señal o una secuencia prepro;

(vii) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (i) a (vi) , y que tiene una secuencia señal heteróloga o una secuencia prepro heteróloga, o que tiene una secuencia señal de levadura;

(viii) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (i) a (vii) , y que tiene una secuencia heteróloga; o

(ix) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (i) a (viii) , en donde el polipéptido comprende al menos un sitio de glicosilación.

7. Una composición que comprende un polipéptido de la reivindicación 6 o el ácido nucleico de la reivindicación 1.

8. Un método para producir un polipéptido recombinante que comprende las etapas de:

(A) (a) proporcionar un ácido nucleico de la reivindicación 1; y (b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, produciéndose de ese modo un polipéptido recombinante; o

(B) el método de (A) , que comprende adicionalmente la transformación de una célula anfitriona con el ácido nucleico de la etapa (A) (a) seguida de la expresión del ácido nucleico de la etapa (A) (a) , produciéndose de ese modo un polipéptido recombinante en una célula transformada.

9. Un método para generar una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido con una actividad glucanasa que comprende las etapas de:

(A)

(a) proporcionar un ácido nucleico molde que comprende la secuencia de la reivindicación 1; y

(b) modificar, suprimir o añadir uno o más nucleóticos a la secuencia molde, o una de sus combinaciones, para generar una variante del ácido nucleico molde; o

(B) el método de (A) , que comprende adicionalmente expresar el ácido nucleico variante para generar un polipéptido de glucanasa variante;

(C) el método de (A) o (B) , en donde las modificaciones, adiciones o deleciones se introducen mediante un método que comprende PCR propensa a error, barajado, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis por PCR sexual, mutagenésis in vivo, mutagenésis por inserción de casetes, mutagenésis de ensamblaje recursivo, mutagenésis de conjunto exponencial, mutagénesis de sitio específico, reensamblaje de genes, Mutagénesis por Saturación de Sitio de Genes (GSSM™) , reensamblaje de ligación sintética (SLR) , recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificada por fosfotioato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex discontinuo, mutagénesis por reparación de apareamiento erróneo, mutagénesis de cepa anfitriona de reparación defectuosa, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis por supresión, mutagénesis por restricción-selección, mutagénesis por restricción-purificación, síntesis artificial de genes, mutagénesis de ensamblaje, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, o cualquiera de sus combinaciones; o

(D) el método de (A) o (B) repetido iterativamente hasta que se produzca una glucanasa tenga una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de un polipéptido codificado por el ácido nucleico molde;

(E) el método de (A) , (B) , (C) o (D) , en donde el péptido de glucanasa variante es termotolerante, y conserva algo de actividad después de ser expuesto a una temperatura elevada;

(F) el método de (A) , (B) , (C) o (D) , en donde el péptido de glucanasa variante tiene incrementada la glicosilación en comparación con la glucanasa codificada por un ácido nucleico molde;

(G) el método de (A) , (B) , (C) o (D) , en donde el péptido de glucanasa variante tiene una actividad glucanasa a alta temperatura, en donde la glucanasa codificada por el ácido nucleico molde no es activo a la alta temperatura;

(H) el método de (A) , (B) , (C) o (D) , en donde el método es repetido iterativamente hasta que se produzca un gen de glucanasa que tenga un nivel de expresión del mensaje o estabilidad superior o inferior al del ácido nucleico molde.

10. Un polipéptido quimérico que comprende

(A) al menos un primer dominio que comprende un péptido señal (SP) , una secuencia prepro, un módulo de unión a carbohidratos, y/o un dominio catalítico (CD) del polipéptido de la reivindicación 6, y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, en donde el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado naturalmente con el péptido señal (SP) ;

(B) el polipéptido quimérico de (A) , en donde el polipéptido o péptido heterólogo no es una glucanasa; o

(C) el polipéptido quimérico de (B) , en donde el polipéptido o péptido heterólogo es amino terminal, carboxi terminal o está en ambos extremos del péptido señal (SP) o dominio catalítico (CD) .

11. Un método para tratar o modificar una composición que comprende poner en contacto una composición con el polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde opcionalmente la composición es una composición farmacéutica, una composición detergente, una solución para lentes de contacto, una composición para el tratamiento de residuos, o un jabón,

o en donde opcionalmente la composición es un combustible, en donde opcionalmente la composición es un alcohol, en donde opcionalmente el alcohol es etanol,

o en donde opcionalmente la composición es un papel, un residuo de papel, un producto de papel reciclado, pasta de papel, producto de papel, madera, producto de madera, pasta de madera, pasta Kraft, artículo textil, tejido, hilo, fibra, o una tela,

o en donde opcionalmente la composición comprende una celulosa, una hemicelulosa, una lignina, un xilano, un glucano, o un manano,

o en donde opcionalmente la composición es una bebida, un alimento, un pienso, un producto lácteo, un suplemento nutricional, o en donde opcionalmente el método es para la producción de alimentos, piensos, suplementos nutricionales o bebidas,

o en donde opcionalmente el método es para reducir la lignina en un papel, un producto de papel, una madera o un producto de madera.

12. Un método para producir una bebida, un pienso, un alimento o un suplemento nutricional que comprende el uso del polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1.

13. Un método para elaborar un combustible que comprende el uso del polipéptido de la reivindicación 6 o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde opcionalmente el combustible es un alcohol, en donde opcionalmente el alcohol es un etanol.

14. Un método para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido de glucanasa, comprendiendo el método las siguientes etapas:

(a) proporcionar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la reivindicación 6; y

(b) identificar un codón en el ácido nucleico de la etapa (a) y remplazarlo por un codón diferente que codifica el mismo aminoácido que el condón remplazado, modificando de ese modo los codones en un ácido nucleico que codifica una glucanasa.

15. Un método para la perforación, la fractura o el tratamiento de pozos de petróleo que comprende el uso de un polipéptido de la reivindicación 6 o un o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1.

FIGURA 5