Fermentación de bacilos moderadamente termofílicos en sacarosa.

Método para la producción de un compuesto de interés que incluye el cultivo de una cepa de Bacillus moderadamentetermofílica en una fuente de carbono que contiene sacarosa,

caracterizado por que la cepa de Bacillus moderadamentetermofìlica se deriva de una cepa progenitora de Bacillus moderadamente termofílica que no es capaz de utilizar lasacarosa como una fuente de carbono por transformación de dicha cepa progenitora con un polinucleótido que incluyeuna secuencia de ADN que codifica un polipéptido con actividad de fosfotransferasa específica de sacarosa y teniendo i)una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº1 o ii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70% ala secuencia de SEC ID nº 1 y/o que incluye una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con actividad desacarosa-6-fosfato hidrolasa y teniendo iii) una secuencia de aminoácido de SEC ID nº 2 ó 4) una secuencia deaminoácido con una identidad de al menos 70% de la secuencia de SEC ID nº 2.

Fermentación de bacilos moderadamente termofílicos en sacarosa [0001] La presente invención se refiere a la modificación genética de cepas de Bacillus moderadamente termofílicas para proporcionar la capacidad de utilizar sacarosa para cepas de Bacillus que originalmente no poseían esta capacidad.

Especies de Bacillus moderadamente termofílicas, preferiblemente aquellas especies que son facultativas anaeróbicas y homolácticas, son organismos ideales para la producción industrial de ácido láctico.

En el contexto de esta invención, especies de Bacillus moderadamente termofílicas pueden crecer entre 37 y 65°C y permiten fermentación industrial a temperaturas de más de 50°C. Esta alta temperatura de fermentación tiene diferentes ventajas cuando se fermenta a escala industrial: menos riesgo de infecciones y mayor pureza de producto, reacciones más rápidas, etcétera. Además, los requisitos de nutrientes de estas bacterias son menos exigentes que los de las bacterias del ácido lático tales como las especies de Lactobacillus, que también permiten procesos industriales relativamente poco costosos.

Especies de Bacillus moderadamente termofílicas incluyen especies aeróbicas y especies facultativas anaeróbicas. El uso de especies facultativas anaeróbicas es preferido, dado que estas especies permiten la fermentación bajo condiciones anaeróbicas, o al menos bajo una baja presión parcial de oxígeno, que es deseable para escala industrial. Tales condiciones evitan la necesidad de aireación costosa y permiten el uso de medios de bajo coste, mientras se minimizan riesgos de contaminación o incluso permitiendo procedimientos de producción no estéril.

Tambien se prefiere usar especies de Bacillus moderadamente termofílicas que son homolácticas. La naturaleza homoláctica permite la producción de ácido láctico de fuentes de hidrocarburo (incluidos azúcares de hexosa y de pentosa; véase WO 04/063382) sin la formación superior a 15 % en peso de productos laterales tales como ácido fórmico y ácido acético. La modificación genética del fenotipo homoláctico se puede aplicar para convertir cepas homolácticas en cepas de producción homofermentadora para otros productos industriales derivables de piruvato. Ejemplos de estos compuestos son piruvato, acetolactato, diacetilo, acetoína, 2, 3-butanodiol, 1, 2-propanodiol, acetato, formiato, acetaldheído, etanol, L-alanina, oxaloacetato, S-malato, succinato, fumarato, 2-oxoglutarato, oxalosuccinato, isocitrato, citrato, glioxilato.

Preferiblemente estas cepas de producción son de esporulación deficiente.

Ejemplos de especies de Bacillus facultativas anaeróbicas y moderadamente termofílicas son Bacillus coagulans, Bacillus smithii, Bacillus termoamylovorans y Bacillus thermocloacae, al menos las primeras dos especies también son homolácticas. Una de las especies preferidas es Bacillus coagulans.

Es deseable en fermentaciones industriales usar materias primas económicas en los medios de fermentación. Por ejemplo, sacarosa o sustratos con sacarosa son frecuentemente usados como fuentes de carbono de bajo coste para fermentaciones industriales. No obstante, se descubrió que no todas las cepas de Bacillus moderadamente termofílicas usadas para fermentaciones industriales poseen la capacidad para utilizar sacarosa como una fuente de carbono. Esta es una desventaja, especialmente si tales cepas han sufrido adaptaciones para mejorar su capacidad de fermentación o potencial producción en una escala industrial. Por ejemplo, cepa de Bacillus coagulans DSM 1 resultó ser una fermentadora muy pobre de sacarosa. Crecimiento sólo escaso y formación ácida es observada usando la sacarosa como fuente de carbono única, lo que es probablemente debido a actividad no específica de sistemas para utilización de otros azúcares.

En la bibliografía, B. coagulans se menciona por ser variable en la capacidad de utilización de sacarosa (De Clerck, E., M. Rodriguez-Diaz, G. Forsyth, L. Lebbe, N. Logan, 2004: Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains. Syst. Appl. Microbiol. 27:50-60 ) . No obstante no hay información disponible de genes implicados en el catabolismo de sacarosa y no hay genes anotados para catabolismo de sacarosa en la secuencia de genoma del B. coagulans 36D1 (http://genome.jgi- psf.org/draft microbes/bacco/bacco.home.html) .

Así, un objeto de la presente invención es modificar genéticamente una cepa de Bacillus moderadamente termofílica originalmente incapaz de utilizar sacarosa como una fuente de carbono para proporcionar a la cepa la capacidad para utilizar sacarosa como una fuente de carbono. Otro objeto de la invención es aprovechar un método para producir un compuesto de interés que comprenda el cultivo de una cepa de Bacillus moderadamente termofílica en una fuente de carbono conteniendo sacarosa.

La presente invención ahora divulga genes y polipéptidos nuevos implicados en el catabolismo de sacarosa y obtenibles de especies de Bacillus moderadamente termofílicas, preferiblemente de especies de Bacillus anaeróbicas facultativas y moderadamente termofílicas, de la forma más preferible de especies de Bacillus anaeróbicas facultativas y moderadamente termofílicas que son homolácticas.

Los polipéptidos nuevos sorprendentemente muestran una homología más bien baja para polipéptidos correspondientes de otras especies de Bacillus, mientras que una homología más alta se observa con polipéptidos correspondientes a especies de Lactobacillus. Los genes y polipéptidos nuevos permiten la introducción de la capacidad de utilización de sacarosa en las cepas de Bacillus moderadamente termofílicas que no utilizan sacarosa de las mismas especies (o cercanamente relacionadas) como las especies donde los genes y polipéptidos nuevos son obtenibles. En particular, los genes nuevos permiten la introducción de material genético mediante autoclonación, es decir usando material genético de especies específicas.

Así, en un aspecto de esta invención, se provee un método para la construcción de una cepa de Bacillus moderadamente termofílica capaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono de una cepa de Bacillus progenitora moderadamente termofílica incapaz de utilizar sacarosa como una fuente de carbono.

En particular, la cepa de Bacillus moderadamente termofílica capaz de utilizar sacarosa como una fuente de carbono es derivada de una cepa de Bacillus progenitora moderadamente termofílica incapaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono por transformación de dicha cepa progenitora con un polinucleótido (gen) necesario para conseguir utilizar la sacarosa. Como se describe aquí, este polinucleótido necesario comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con actividad de fosfotransferasa específica de sacarosa y teniendo i) una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 o ii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de como mínimo 70%, preferiblemente de como mínimo 75, 80, 85, 90, 95%, de la SEC ID nº 1 y/o con una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con actividad de hidrolasa de sacarosa-6-fosfato y teniendo iii) una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 o iv) una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70%, preferiblemente de al menos 75, 80, 85, 90, 95%, a la secuencia de SEC ID nº 2.

La introducción del polinucleótido para conseguir utilizar sacarosa en la cepa de Bacillus moderadamente termofílica de interés puede hacerse usando cualquier procedimiento de transformación adecuado conocido por el experto en la técnica, incluída la transformación de protoplasto o fusión de protoplasto, electroporación, transformación biolística, conjugación o transformación de células naturales competentes. Por ejemplo, un procedimiento de transformación como se describe en WO 2007/085443, que es incorporado aquí por referencia, puede ser utilizado.

El polinucleótido para alcanzar la utilización de sacarosa puede ser introducido usando un plásmido que se replica de manera autónoma o por integración cromosómica. Éste se prefiere para aplicación industrial, dado que la integración cromosómica es generalmente considerada como más estable y garantiza una distribución estable del polinucleótido sobre las células descendientes. La fermentación de la misma sacarosa puede ser una presión de selección para el mantenimiento del polinucleótido para alcanzar la utilización de sacarosa. La introducción del polinucleótido en el cromosoma puede realizarse por recombinación no homóloga al igual que por homóloga.

La recombinación homóloga es preferida, dado que abre la oportunidad de introducir, eliminar o simultáneamente introducir y eliminar una funcionalidad en/desde el cromosoma... [Seguir leyendo]

1. Método para la producción de un compuesto de interés que incluye el cultivo de una cepa de Bacillus moderadamente termofílica en una fuente de carbono que contiene sacarosa, caracterizado por que la cepa de Bacillus moderadamente 5 termofìlica se deriva de una cepa progenitora de Bacillus moderadamente termofílica que no es capaz de utilizar la sacarosa como una fuente de carbono por transformación de dicha cepa progenitora con un polinucleótido que incluye una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con actividad de fosfotransferasa específica de sacarosa y teniendo i) una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº1 o ii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70% a la secuencia de SEC ID nº 1 y/o que incluye una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con actividad de sacarosa-6-fosfato hidrolasa y teniendo iii) una secuencia de aminoácido de SEC ID nº 2 ó 4) una secuencia de aminoácido con una identidad de al menos 70% de la secuencia de SEC ID nº 2.

2. Método según la reivindicación 1, donde el compuesto de interés es ácido láctico.

3. Método para la construcción de una cepa de Bacillus moderadamente termofílica capaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono que incluye la transformación de una cepa de Bacillus progenitora moderadamente termofílica incapaz de utilizar sacarosa como fuente de carbono con un polinucleótido que incluye una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con actividad de fosfotransferasa específica de sacarosa y teniendo i) una secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 1 o ii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70% de la secuencia de SEC ID nº 1 y/o que incluye una secuencia de ADN que codifica un polipéptido con actividad de sacarosa-6-fosfato hidrolasa y teniendo iii) una secuencia de aminoácido de SEC ID nº 2 o iv) una secuencia de aminoácido con una identidad de al menos 70% de la secuencia de SEC ID nº 2.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la cepa de Bacillus moderadamente termofílica 25 es anaeróbica facultativa.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la cepa de Bacillus moderadamente termofílica es homoláctica.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la cepa de Bacillus moderadamente termofílica es Bacillus coagulans.

7. Polipéptido con actividad de fosfotransferasa específica de sacarosa y con una secuencia de aminoácido de SEC ID

nº 1 o una secuencia de aminoácido con una identidad de al menos 70% a la secuencia de SEC ID nº 1. 35

8. Polipéptido con actividad de sacarosa-6-fosfato hidrolasa y con una secuencia de aminoácido de SEC ID nº 2 o una secuencia de aminoácido con una identidad de al menos 70% a la secuencia de SEC ID nº 2.

9. Polinucleótido que codifica el polipéptido de las reivindicaciones 7 u 8. 40

10. Polinucleótido de la reivindicación 9 teniendo una secuencia de SEC ID nº 3 o SEC ID nº 4.