Procedimiento de expansión de células madre adultas de sangre, en particular sangre periférica, y aplicación relativa en el campo médico.

Procedimiento de expansión de células madre adultas de sangre,

en particular pero no solamente de la sangreperiférica, que comprende las siguientes etapas:

a) una primera etapa de expansión de las células madre de sangre, inmediatamente después de que se hayantomado del paciente, por medio del tratamiento in vitro con MCSF en una concentración comprendida entre 8-15nM y

b) una segunda etapa de purificación de las células madre expandidas, c) expansión de las células madre desangre purificadas en la etapa b) por medio del tratamiento in vitro con MCSF en una concentración comprendidaentre aproximadamente 35-55 nM durante 24-72 horas.

Procedimiento de expansión de células madre adultas de sangre, en particular sangre periférica, y aplicación relativa en el campo médico La presente invención se refiere a un procedimiento de expansión para células madre de la sangre, en particular pero no solamente de la sangre periférica, de mamíferos adultos, y a la aplicación relativa en el campo médico, en particular en el campo veterinario, para el tratamiento de lesiones, patologías inflamatorias crónicas y/o agudas, patologías neurológicas y neurodegenerativas.

En el presente documento, y a continuación en la descripción del mismo, y como se conoce en la literatura, por la palabra "expansión" se quiere significar el proceso de incremento del número de células por división celular o bien, como en el caso específico descrito y reivindicado, por "desdiferenciación", esto es, el proceso por el que las células presentes en la sangre se transforman en células madre después de un tratamiento in vitro adecuado, como se verá a continuación en el presente documento.

En los últimos años, el uso de células madre en tratamiento ha tenido una gran aprobación debido al éxito obtenido en el tratamiento de varias patologías que previamente se pensaba que eran incurables. Sin embargo, los procesos para la obtención de células madre conocidos hasta la fecha han sido laboriosos y caros.

Las células madre pluripotentes (CMP) son una fuente disponible no sólo para la investigación sino también para la creación de fármacos y para trasplantes (Wagers A. J. et al., 2002; Griffith L. G. et al., 2002) .

Existen dos amplias categorías de células madre, embrionaria y adulta: la primera deriva de embriones, y más exactamente de blastocitos de 8 días, mientras que, por el contrario, las células madre adultas se pueden obtener principalmente de la médula ósea, tejido adiposo o muscular y de la sangre periférica.

La definición de célula madre está constantemente evolucionando y, en este momento, no existe un consenso general ni un procedimiento estándar para aislarlas o identificarlas. Para todas estas células, embrionarias (ES) y adultas, tanto hematopoyéticas (CMH) como mesenquimales (CMM) (Kuwana M. et al., 2003) , se han identificado diferentes marcadores genéticos, de los que algunos son comunes para muchos tipos de células (Condomines M. et al., 2006; Kang W. J. et al., 2006; Zhao Y. et al., 2003; Rabinovitch M. et al., 1976) .

En particular, Zhao Y. et al, tanto en el artículo "A human peripheral blood monocito-derived subset acts as pluripotent stem cells" como en el documento WO 2004/043990, divulga un procedimiento para preparar células madre derivadas de monocitos que incluye las etapas de aislar un monocito de sangre periférica, ponerlo en contacto con un componente mitógeno y posteriormente cultivar el monocito de sangre periférica bajo condiciones adecuadas para la propagación de las células.

Este procedimiento, que requiere en primer lugar una etapa de aislamiento del monocito y en segundo lugar una etapa de expansión en un medio de cultivo, implica periodos de tiempo muy largos para la obtención de un número significativo de células madre, del orden de 15-20 días, y no puede obtener células madre del tipo totipotente, esto es, no especializadas, adecuadas para inocularse directamente en el paciente en un periodo de tiempo muy corto desde la primera extracción.

Numerosos trabajos científicos describen la capacidad de las células madre para regenerar diferente tipos de lesiones, regenerando tejidos que están dañados mecánicamente o dañados por varias patologías, eliminando desde la raíz las causas que generaron la patología y no simplemente actuando sobre los efectos de las mismas.

En este momento, la investigación está más orientada hacia el uso de células madre aisladas de tejido embrionario, fetos o del cordón umbilical, pero esto está planteando varias cuestiones jurídicas y éticas. Ante todo, a día de hoy el uso de estas células trae varias contraindicaciones tales como: riesgos de infección, de rechazo si se trasplantan y, en caballos, la aparición de teratomas.

Por lo tanto, para eludir estos problemas, se ha considerado el uso en el tratamiento "in vivo" de células madre autólogas aisladas preferentemente de médula ósea, tejido adiposo o sangre periférica. Estos procedimientos, usando a partir de células madre adultas, proporcionan una etapa de diferenciación "in-vitro" (o "ex vivo") de las células madre en la línea celular deseada por medio de factores de inducción de la diferenciación específicos, y una posterior etapa de trasplante "in vivo" de la línea celular diferenciada obtenida. En estos procedimientos, el límite se debe al hecho de que se producen fenómenos de rechazo observables debido a que las células diferenciadas reintroducidas en el paciente no se reconocen como células propias, porque durante la etapa de diferenciación inducida in-vitro éstas pierden los factores de auto-reconocimiento.

En el hombre, tomar células madre de la sangre periférica implica purificarlas por medio de un proceso denominado "aféresis" o "leucoféresis". En la práctica, las células se extraen de la sangre, se recogen, y a continuación se inoculan en pacientes inmediatamente después de la quimio o radioterapia. En la aféresis, que dura de 6 a 8 horas, se toma la sangre de la vena de un brazo o de una vena en el cuello o en el pecho, y se hace pasar a través de una máquina que retira las células madre. La sangre, purificada de este modo, vuelve al paciente, mientras que se preservan las células recogidas por medio de refrigeración en nitrógeno líquido (Condomines M. et al., 2006; Kang W.J. et al., 2006) . Esta técnica no sólo es dolorosa, sino también extremadamente estresante para el paciente. Además, es impracticable para animales de tamaño pequeño o bien grande; sobre todo, la técnica no proporciona una discriminación y/o purificación real de las células madre circulantes.

En la actualidad, en la ciencia veterinaria se usan células madre de forma exitosa principalmente en la reconstrucción de tendones y ligamentos con lesiones. Las técnicas principales para la purificación son:

- uso de factores de crecimiento o derivados de plaquetas (TGF-B, VEGF) , pero los costes económicos de su extracción son prohibitivos (Hou M. et al., 2006) ;

-aislamiento de células madre tomadas de la médula ósea. Esta técnica permite la purificación y después el uso 10 para tratamiento sólo del 15 % de las células contenidas en el material extraído;

- aislamiento de células madre tomadas de tejido adiposo. Esta técnica, que requiere la retirada quirúrgica previa de cantidades considerables de tejido del animal donante, no permite una administración intravenosa;

- IGF-1 (factor de crecimiento insulinoide 1) conocido como tendotrofina (Fiedler J. et al., 2006) ;

-UBM (matriz de vejiga urinaria) : es un derivado del cerdo que contiene citocinas (pero no células nucleadas) , que 15 induce la cicatrización de la herida pero no la regeneración de la zona con lesiones (Zhang Y.S. et al., 2005) .

En vista de todo lo anterior, es obvio que se necesitan procedimientos para la expansión y purificación de células madre adultas a partir de fuentes fácilmente accesibles que además deben permitir la obtención de células madre adecuadas para su uso como medicamento en el campo médico-veterinario que, una vez se administren en el mamífero, no dé lugar a un fenómeno de rechazo y que sean fáciles de preservar.

También existe una necesidad obvia de obtener células madre del tipo pluripotente y totipotente, esto es, no especializada, que se puedan inocular directamente en el paciente, y con periodos de tiempo de producción mucho más cortos que los proporcionados en la actualidad.

Los autores de la presente invención han perfeccionado ahora un procedimiento para la expansión y purificación in vitro de células madre de sangre periférica, tal como permitir la obtención de células madre que no proporcionan efectos colaterales tales como fenómenos de rechazo, infección, teratomas, una vez se administren en el mamífero adulto, que puedan diferenciarse "in vivo" y comportarse como células madre pluripotentes.

Los autores han observado que las células expandidas de este modo, una vez se inyectan por vía local o por vía intravenosa, adquieren "in vivo" (y no "in-vitro", como en procedimientos conocidos en el estado de la técnica por medio de factores de crecimiento y/o estímulos químicos adecuados (Gulati R. et al., 2003; Katz R. L. et al., 2002; Okazaki T. 30 et al., 2005) ) todas las características morfológicas y químicas de las células macrófagas, linfocíticas,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de expansión de células madre adultas de sangre, en particular pero no solamente de la sangre periférica, que comprende las siguientes etapas:

a) una primera etapa de expansión de las células madre de sangre, inmediatamente después de que se hayan 5 tomado del paciente, por medio del tratamiento in vitro con MCSF en una concentración comprendida entre 8-15 nM y

b) una segunda etapa de purificación de las células madre expandidas, c) expansión de las células madre de sangre purificadas en la etapa b) por medio del tratamiento in vitro con MCSF en una concentración comprendida entre aproximadament.

3. 55 nM durant.

2. 72 horas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha etapa a) in vitro con MCSF tiene una duración comprendida entre 24 y 96 horas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha etapa a) in vitro con MCSF tiene una duración comprendida entre 48 y 72 horas.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento in vitro de la etapa a) se inicia no más 15 de 10 minutos después de que se haya tomado la muestra, ventajosamente no más de 5 minutos.

5. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha concentración de MCSF en la etapa a) es preferentemente de 10 nM.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha concentración de MCSF en la etapa c) es preferentemente de 50 nM, más preferentemente de 45 nM.

7. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el tratamiento in vitro con MCSF en la etapa a) y/o etapa c) dur.

2. 48 horas, preferentement.

4. 48 horas.

8. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de purificación b) se produce por medio del fraccionamiento en un gradiente de Ficoll.

9. Composición farmacéutica que comprende las células madre adultas obtenidas de acuerdo con el procedimiento,

como se define en cualquier reivindicación de 1 a 8, a una concentración comprendida entr.

9. 250x103 células/ml, preferentement.

10. 120x103 células/ml, como principio activo, junto con coadyuvantes y/o excipientes farmacológicamente aceptables, formulándose dicha composición para inyección intravenosa, para su uso en el tratamiento de lesiones elegidas del grupo que consiste en lesiones cutáneas, lesiones en los tendones, en los ligamentos, en los huesos, en las membranas mucosas en mamíferos, o fracturas, de patologías neurológicas o neurodegenerativas elegidas del grupo que consiste en enfermedad de Cushing, sacudida de cabeza, síndrome de Wobbler, dificultades respiratorias, paresia de las extremidades en mamíferos, de patologías inflamatorias agudas o crónicas elegidas de laminitis, periostitis, gastritis, artrosis, inflamaciones provocadas por agentes víricos, bacterianos, parásitos, micóticos en mamíferos, del síndrome de dilatación-torsión del estómago en mamíferos.

10. Composición farmacéutica que comprende las células madre adultas obtenidas de acuerdo con el procedimiento,

como se define en cualquier reivindicación de 1 a 8, a una concentración comprendida entre 4-40x106 células/ml, preferentemente 7x106 células/ml, como principio activo, junto con coadyuvantes y/o excipientes farmacológicamente aceptables, formulándose dicha composición para aplicación local, para su uso en el tratamiento de lesiones elegidas del grupo que consiste en lesiones cutáneas, lesiones en los tendones, en los ligamentos, en los huesos, en las membranas mucosas en mamíferos, o fracturas, de patologías neurológicas o neurodegenerativas elegidas del grupo que consiste en enfermedad de Cushing, sacudida de cabeza, síndrome de Wobbler, dificultades respiratorias, paresia de las extremidades en mamíferos, de patologías inflamatorias agudas o crónicas elegidas de laminitis, periostitis, gastritis, artrosis, inflamaciones provocadas por agentes víricos, bacterianos, parásitos, micóticos en mamíferos, del síndrome de dilatación-torsión del estómago en mamíferos.

11. Composición para su uso según la reivindicación 10, que comprende además un antibiótico como principio activo 45 en una concentración comprendida entre 5-15 nM, preferentemente 10 nM.

12. Composición para su uso según la reivindicación 11, en la que el antibiótico es gentamicina.

13. Composición para su uso según la reivindicación 9, en la que dicha composición comprende células madre adultas obtenidas en una concentración igual a 150x103 células/ml y se administra una vez por semana por vía intravenosa.

14. Composición para su uso según cualquier reivindicación de 9 a 13, en la que dichos mamíferos se eligen de entre hombres, caballos, gatos o perros.