Disolución en gradiente de auto-calibración en un ensayo de constituyentes y aparato de disolución en gradiente realizado en una muestra de película delgada.

Método para determinar la dilución relativa de una solución que contiene un ligando que está dirigido contra un analito objetivo,

y una muestra de líquido que contiene el analito objetivo que se ha de analizar, cuya muestra de analito objetivo es miscible con dicha solución de ligando, conteniendo al menos uno de la citada solución y la citada muestra un marcador sensible detectable, comprendiendo dicho método los pasos de:

a) poner una cantidad de la citada solución en una zona de una cámara de reacción plana que tiene una dimensión pequeña a través del espesor;

b) poner una cantidad de dicha muestra de analito objetivo en una zona adyacente a dicha cámara plana;

c) permitir o hacer que dicha solución y dicha muestra se mezclen entre sí hasta que se cree un gradiente de mezcla en una mezcla de solución-muestra en la citada cámara;

d) formar imagen o explorar electrónicamente dicho gradiente de mezcla en la citada cámara entre un primer lugar que contiene una cantidad no diluida de la citada solución y un segundo lugar que contiene una cantidad no diluida de la citada muestra de analito objetivo; y

e) calcular una concentración o dilución relativa de cada una de la citada solución y la citada muestra midiendo la concentración de dicho marcador sensible detectable en la citada mezcla.

Disolución en gradiente de auto-calibración en un ensayo de constituyentes y aparato de disolución en gradiente realizado en una muestra de película delgada

Antecedentes de la invención

1. Campo técnico Esta descripción se refiere a métodos y aparato para medir titers de anticuerpos en un sistema automatizado que no requiere múltiples disoluciones. El sistema proporciona un método sencillo para crear una disolución in-situ dentro de una cámara de análisis de muestras sin el uso de cualesquiera componentes de manipulación de fluidos de precisión y, además, para usar los mismos principios para proporcionar una amplia gama de disoluciones de muestras dentro de la cámara de manera que se evite la necesidad de operaciones adicionales de disolución cuando se trata con muestras que contienen posiblemente amplias gamas de concentraciones de analito.

2. Información básica En la mayoría de los ensayos es necesario proporcionar una disolución exacta de la muestra que se ha de analizar para que la concentración del analito pueda ser llevada al intervalo útil del ensayo, y, puesto que esta disolución afecta a la concentración del analito, la precisión y la exactitud de la prueba dependen en gran medida de la precisión y de la exactitud de la disolución. Una razón para esta disolución es que los inmuno ensayos son afectados por un fenómeno conocido como el efecto prozona. El término “prozona”, según se utiliza en esta descripción, se referirá a condiciones de exceso de anticuerpos en las que generalmente en inmuno ensayos basados en precipitación o aglutinación se inhiben o impiden las reacciones; el aplazamiento, en el que condiciones de exceso de antígenos en un inmuno ensayo en el que se inhiben reacciones de aglutinación o precipitación; y el “efecto de gancho” en el que condiciones de exceso de antígenos dan lugar a resultados falsamente bajos. Las condiciones en las que ocurren efectos de prozona pueden dar lugar a resultados falsamente negativos y falsamente bajos, con resultados catastróficos para el paciente.

Cada combinación de ensayos tiene un intervalo de trabajo empíricamente definido y los ensayos deben ser realizados con muestras y reactivos en las diluciones apropiadas. Este tipo de disolución ha sido lograda tradicionalmente por medio del uso de componentes de manipulación de fluido de precisión o repetición manual del ensayo en diluciones mayores del anticuerpo para ver si el negativo es un verdadero negativo. Aunque estas pueden ser muy precisas, requieren calibración cuidadosa y se suman en gran medida a la complejidad de la instrumentación automatizada. Además, el intervalo de analito presente en la muestra puede exceder del intervalo dinámico del ensayo y puede requerir dilución adicional de la muestra para conseguir resultados exactos.

Los ensayos serológicos, tales como para anticuerpos para enfermedades patógenas infecciosas, son importantes porque informan de cualquier inmunidad existente debida a inmunización o a exposición previa o actual, dependiendo de la clase de inmunoglobulina presente, al agente infeccioso. Similarmente, aquellos pueden ser usados para detectar auto-inmunidad y similares. Existen un cierto número de tipos de ensayos realizados, incluyendo aglutinación, fijación de complementos, precipitación, etc. Una característica casi universal de tales pruebas es la necesidad de disolver la muestra cierto número de veces con el fin de detectar el punto en el que los anticuerpos ya no son efectivos para originar una prueba positiva. A esto se hace referencia como el “titer”, siendo el titer la dilución más elevada del suero o plasma del paciente que produce reacción detectable de aglutinación o medida con el antígeno de prueba. Esto requiere, en efecto, la realización de muchas pruebas separadas para llegar al resultado. Otro problema de tales ensayos es que los puntos finales son a veces difíciles de determinar, añadiendo así un error significativo a la determinación del titer. La automatización puede aumentar la eficacia y la exactitud de la prueba, pero es muy difícil realizar las disoluciones mediante un instrumento, y el consumo de tiempo, incluyendo la necesidad de definir primeramente la dilución deseada, que puede variar de prueba aprueba y los múltiples pasos de dilución son muy complejos.

Seria deseable proporcionar un aparato para medir titers de anticuerpos en un sistema automatizado que no requiera múltiples diluciones y que elimine el riesgo de negativos falsos debido al efecto de prozona.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método según se reivindica en la reivindicación 1. Se utiliza un marcador sensible para permitir la medición de la concentración de los reactivos añadidos a la cámara in vitro en la zona de la reacción que está siendo analizada. Un marcador sensible significa, en esta descripción, un tinte o substancia detectable que no interfiere con la reacción que está siendo analizada y que se difunde a una velocidad próxima a los reactivos a los que se añade. Marcadores sensibles pueden ser un tinte o tintes que puedan ser medidos por medios ópticos tales como absorción o emisión fluorescente. El marcador sensible está homogéneamente presente ya sea estando en disolución o en suspensión coloidal con al menos uno de dos o más líquidos que se han de añadir a continuación a, y permitidos mezclarse en, la delgada cámara de análisis que está siendo utilizada.

Puesto que a la altura de la cámara es menor que 100 micrómetros (100 μm) , y preferiblemente menor que 20 micrómetros (20 μm) , y las dimensiones laterales de la cámara son preferiblemente de varios centímetros, la diferencia mayor que 1.000 veces en las dimensiones vertical y horizontal dará lugar a que se alcance un equilibrio en la dimensión vertical de manera extremadamente rápida, mientras que el equilibrio en la dimensión lateral tomará cientos o miles de veces más. Si se analizan la imagen completa formada o escaneada de la cámara de reacción y las pequeñas zonas discretas de la imagen o escaneo, donde los aspectos laterales de las zonas de análisis discretas están en el intervalo de 1 a 3 veces la altura de la cámara, el volumen que está siendo sometido al análisis estará en equilibrio aproximado. Zonas tomadas a distancias de milímetros o mayores, laterales a la primera zona, tendrán diferentes condiciones de equilibrio. La señal procedente del marcador sensible añadido se mide antes, y después de la subsiguiente mezcladura o difusión con los reactivos adicionales, para permitir el cálculo de la concentración final del marcador sensible medido, refleja la relativa dilución de los componentes. En casos en los que hay más de dos líquidos presentes en una cámara, puede ser utilizado más de un marcador sensible que pueda ser distinguido de los otros marcadores sensibles, cada uno añadido a uno de los componentes añadidos, para permitir el cálculo de las proporciones relativas de cada uno de los componentes. Si la concentración inicial de los constituyentes de los componentes es conocida, las concentraciones relativas pueden ser utilizadas para calcular la concentración absoluta de los componentes añadidos en masa por unidad de volumen. De ese modo las concentraciones relativas de reactivos añadidos en cualquier zona pequeña analizada pueden ser tratadas como reacción discreta visual en recipiente o cámara cuyas concentraciones de reactivos añadidos son calculables y los resultados de la unión sobre libertad o aglutinación u otra señal empleada en el inmuno ensayo que está siendo realizado pueden ser medidos y representados gráficamente como la señal obtenida por dilución calculada de muestra o nivel por concentración de anticuerpo añadido o antígeno añadido.

Es, por lo tanto, un objeto de esta invención proporcionar un método en el que se usen mezcladura y difusión para crear un gradiente de concentración entre dos o más líquidos miscibles en una muestra de película delgada en una cámara de manera que el equilibrio en la dimensión pequeña de la cámara es muy rápido y las diferencias de concentraciones en el eje largo de la cámara no alcanzan el equilibrio durante el tiempo del ensayo, y siendo la interdilución relativa final medida mediante la concentración relativa de un marcador sensible que no participa en cualquiera de las reacciones químicas deseadas y cuyas propiedades son tales que permiten su medición exacta en cualquier punto de la cámara de reacción.

Descripción de los dibujos La figura 1 es una vista esquemática en planta de una cámara que se utiliza en la realización del método de esta invención;

La figura 2 es una vista... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar la dilución relativa de una solución que contiene un ligando que está dirigido contra un analito objetivo, y una muestra de líquido que contiene el analito objetivo que se ha de analizar, cuya muestra de analito objetivo es miscible con dicha solución de ligando, conteniendo al menos uno de la citada solución y la citada muestra un marcador sensible detectable, comprendiendo dicho método los pasos de:

a) poner una cantidad de la citada solución en una zona de una cámara de reacción plana que tiene una dimensión pequeña a través del espesor;

b) poner una cantidad de dicha muestra de analito objetivo en una zona adyacente a dicha cámara plana;

c) permitir o hacer que dicha solución y dicha muestra se mezclen entre sí hasta que se cree un gradiente de mezcla en una mezcla de solución-muestra en la citada cámara;

d) formar imagen o explorar electrónicamente dicho gradiente de mezcla en la citada cámara entre un primer lugar que contiene una cantidad no diluida de la citada solución y un segundo lugar que contiene una cantidad no diluida de la citada muestra de analito objetivo; y

e) calcular una concentración o dilución relativa de cada una de la citada solución y la citada muestra midiendo la concentración de dicho marcador sensible detectable en la citada mezcla.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha solución contiene un marcador sensible detectable.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la citada muestra de líquido contiene un marcador sensible detectable.

4. El método de la reivindicación 1, en el que tanto la citada solución como la citada muestra de líquido contienen marcadores sensibles detectables y en el que dichos marcadores sensibles producen diferentes señales detectables.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicho paso de permitir o hacer que se produzca la mezcladura se realiza bombeando dicha solución y dicha muestra dentro de la citada cámara.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el citado paso de permitir o hacer que se produzca la mezcladura se realiza desviando el flujo de al menos una de las citadas solución y muestra de líquido hacia dentro de la citada cámara.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la citada cámara tiene un espesor menor que 1 mm.

8. El método de la reivindicación 6, en el que dicha cámara tiene un espesor menor que 200 μm.

9. El método de la reivindicación 1, que comprende el paso adicional de añadir un agente de aumento de viscosidad que puede formar al menos un gel parcial en la citada muestra de manera que permita que la muestra sea incubada durante un periodo de tiempo dilatado a continuación del citado paso de mezcladura con el fin de que prosiga una reacción retardada.

10. El método de la reivindicación 1, en el que se realiza una curva de calibración de valoración en la misma cámara que la de análisis de muestra.