Procedimiento y dispositivo de clasificación, de visualización y de exploración de datos biológicos.

Procedimiento para ser utilizado en un autómata de análisis de líquido biológico apto para detectar células en ellíquido y para determinar una n-tupla (xi(X1.

..Xn,Ci)) que comprende al menos cuatro parámetros físicos (n>3)medidos para cada célula detectada, siendo dicho procedimiento para la clasificación 5 por discriminación y para elrecuento en un conjunto de al menos tres clases celulares (Ci) y para su representación y que comprende lassiguientes etapas:

a) almacenar, previamente, una pluralidad de transformaciones matemáticas (Tn->m) de una pluralidad de n-tuplasen m-tuplas (yj(Y1...Ym, Cj)), m1,2,3) de una pluralidad de ntuplas(xi(X1...Xn,Ci)) en 3-tuplas, 2-tuplas, o 1-tuplas, determinada en función de conocimientos estadísticos sobrelas células que constituyen las clases celulares de un líquido biológico normal, que permite colocar las clasescelulares (Cdi) de un líquido biológico que presenta las características estadísticas medias en zonas distintas delespacio de 3 dimensiones, de superficie de 2 dimensiones, o del eje de una dimensión;

d) recibir una pluralidad de n-tuplas (xi(X1...Xn,Ci)), como resultados del análisis de un líquido biológico;

e) asociar una primera clasificación arbitraria (Csi) a las n-tuplas recibidas;

f) seleccionar un subconjunto de las n-tuplas en función de sus clases (Csi);

g) seleccionar y aplicar una transformación (Tn->m) en m-tuplas a las n-tuplas seleccionadas;

h) seleccionar y aplicar un filtro de discriminación (A) a las m-tuplas, lo que conlleva la actualización de las clases(Cdi) de las n-tuplas;

i) reiterar las etapas f), g) y h) seleccionando un subconjunto de n-tuplas (Csi) y/o una transformación distinta de laanterior y/o un filtro distinto del anterior, definiendo cada iteración un paso de un algoritmo de discriminación,estando este algoritmo definido por la serie de las aplicaciones de transformaciones y de filtros;

j) seleccionar un subconjunto de las n-tuplas a mostrar, en m-tuplas, en función de sus clases;

k) aplicar una etiqueta de presentación particular (COLk) a las n-tuplas en función de su clase (Ck);

l) aplicar una transformación en 3-tuplas o 2-tuplas a las n-tuplas, o incluso en 1-tuplas (Tn->1,2,3) a las n-tuplasseleccionadas;

m) mostrar el resultado de la transformación en 3-tuplas o 2-tuplas en una pantalla (18), o cualquier otro soporte depresentación, estando cada clase celular discriminada representada por una nube bidimensional o tridimensionaldinámica de puntos que llevan etiquetas.

Procedimiento y dispositivo de clasificación, de visualización y de exploración de datos biológicos

Antecedentes de la invención La presente invención se refiere al campo general del análisis de líquidos biológicos y, más particularmente, al campo de los autómatas para análisis de líquidos biológicos.

Más exactamente, la invención se refiere a los procedimientos de clasificación de poblaciones celulares mediante recuento y discriminación a partir de un tratamiento de datos tales como los procedentes de un dispositivo de análisis de líquido biológico. Dicho procedimiento es para utilizarlo en un autómata de análisis.

La posibilidad de analizar gran número de estructuras a escala celular o sub-celular presenta un interés considerable en investigación fundamental, ya sea para estudios de medicamentos o también como herramienta de diagnóstico. El análisis sistemático de gran número de células biológicas permite acercarse a la biología mediante la estadística, es decir que una o más de las propiedades celulares son estudiadas en gran número de células.

La citometría de flujo es una de las técnicas adaptadas al estudio estadístico de poblaciones celulares, ya que las células son estudiadas una a una en una muestra de varios cientos o miles de células.

Mediante una preparación adaptada de las células, realizada generalmente mediante introducción de un colorante o de un agente fluorescente denominado más habitualmente «sonda molecular», informaciones relativas a estas células son accesibles al biólogo. Se trata normalmente de la determinación del contenido intracelular como ADN, ARN, proteínas, especies iónicas, el contenido de hemoglobina. La utilización de sondas moleculares que asocian, según el principio de los antígenos de superficie, un anticuerpo y un luminóforo permite revelar funciones específicas localizadas en la superficie de las membranas de las células.

Los principios de la citometría de flujo son los siguientes. Los objetos microscópicos a analizar son transportados mediante una trayectoria líquida al punto de focalización de un haz de luz, generalmente un láser. Detectores se sitúan según ejes de puntería específicos con el fin de recoger las señales de interacción luz-materia.

Un primer detector, colocado en las proximidades del eje del haz láser incidente, mide la difracción en ángulos pequeños: generalmente, tiene unas dimensiones para ser sensible a las frecuencias espaciales reducidas, es decir al volumen de la partícula y a su índice de refracción. El haz láser directo que no haya interaccionado con esta partícula es bloqueado por una máscara.

Otros detectores pueden estar colocados a 90º del eje del haz incidente. La luz detectada es analizada según uno o más componentes espectrales que corresponden a luces de fluorescencia o de difracción.

También se realizan mediciones eléctricas tales como la medición de resistividad mediante el principio de puerta electrónica bien conocido por el experto en la materia. Esta técnica se detalla, por ejemplo, en el artículo de Volker Kachel “Electrical Resistance Pulse Sizing: Coulter Sizing” aparecido en Flow Cytometr y and sorting, Segunda Edición, 1990, Wiley-Liss, Inc Editor, p. 45-80.

En principio, una puerta electrónica consiste en hacer transitar a cada célula biológica a través de un orificio muy pequeño. Este orificio es atravesado por una corriente constante cuya intensidad está modulada por la variación de resistencia eléctrica inducida por el tránsito de la partícula por dicho orificio. Esta señal es aproximadamente proporcional al volumen de la célula. La puerta electrónica también puede estar alimentada con corriente alterna según el documento US 4.791.355.

Los analizadores de hematología comprenden también, un canal óptico que permite medir la absorbancia de una partícula que pasa por la cubeta de medición.

El objetivo de un analizador de hematología, por ejemplo, es contar las diferentes células presentes en una muestra de sangre, diferenciar estas células y, por lo tanto, poder dar una proporción de cada una de las clases celulares con respecto al conjunto de la muestra.

La interpretación de las mediciones obtenidas de un contador de glóbulos que funciona en sangre completa y que permite el recuento y la diferenciación de las poblaciones celulares requiere, en la gran mayoría de los casos, una representación gráfica en forma de matriz de dos dimensiones.

Con este objetivo, las poblaciones representadas se identifican según dos parámetros físicos que son óptico, eléctrico, o ambos. En el caso preciso de la matriz LMNE que es la representación convencional de sub-poblaciones de leucocitos en los aparatos HORIBA ABX (análisis 5 diff) , las dos mediciones utilizadas son la absorbancia y la resistividad. Esta matriz se denomina LMNE ya que permite la diferenciación y el recuento de Linfocitos, Monocitos, Neutrófilos y Eosinófilos, que son las poblaciones de glóbulos blancos, o leucocitos, normalmente presentes en la sangre.

Esta representación permite visualizar la mayoría de las poblaciones de glóbulos blancos, sin embargo esta visualización gráfica solamente tiene en cuenta dos parámetros físicos obtenidos en el analizador.

En las nuevas generaciones de analizadores, es posible obtener más parámetros físicos tales como, por ejemplo, la difracción en ángulos pequeños, denominada FSC, la difusión a 90º, denominada SSC, una trayectoria de fluorescencia con, como reactivo, el tiazol naranja, denominada FL1 y finalmente la resistividad denominada RES. También pueden preverse otras fluorescencias con, como reactivo, un anticuerpo marcado con ayuda de un fluorócromo, por ejemplo.

Actualmente, cuando se miden más de dos variables por célula o partícula, la visualización en una pantalla bidimensional se realiza tradicionalmente mediante la selección de dos variables. Esto consiste, por lo tanto, en realizar una proyección ortogonal en el plano de estas dos variables.

Sin embargo, según los elementos observados y las mediciones disponibles, estas proyecciones ortogonales no están siempre adaptadas a la visualización y a la discriminación automática de las clases de elementos.

La patente US 6.630.990 depositada por la compañía Abbott «Optical method and apparatus for red blood cell differentiation on a cell-by-cell basis, and simultaneous analysis of white blood cell differentiation» propone una proyección de los datos en un espacio tridimensional y se basa en el modelo de Mie para determinar la concentración de hemoglobina, la madurez y la forma de los glóbulos rojos de una muestra.

La patente US 6.944.338 de la compañía Becton Dickinson & Co. «System for identifying clusters in scatter plots using smoothed polygons with optimal boundaries» genera histogramas bidimensionales basados en la densidad para discriminar poblaciones.

La patente US 6.662.117 de la compañía Sysmex Corp. «Particle analyzer and particle classifying method» describe la utilización de una matriz basada en la varianza y la covarianza de las características de las células a discriminar. El tratamiento utiliza histogramas bidimensionales para realizar una clasificación.

La solicitud de patente WO 2006/015056 de la compañía Dako Cytomation «ENHANCING FLOW CYTOMETRY DISCRIMINATION WITH GEOMETRIC TRANSFORMATION» describe una clasificación de dos tipos de partículas en tiempo real gracias a un tratamiento lineal de los datos. Los documentos US 6524793, US 7369696, US 2008/172185 y FR 2733596 representan otros ejemplos de clasificación celulares.

Ninguno de los documentos mencionados describe, por lo tanto, un procedimiento o un dispositivo apto para gestionar un número elevado de datos disponibles por célula y apto para realizar una clasificación automática en al menos tres clases celulares. Ninguno de los documentos tampoco describe un tratamiento que permite obtener una visualización en una única pantalla de todas las clases celulares presentes en una muestra, con una diferenciación y un recuento de estas células. Los procedimientos descritos tampoco permiten aislar, por ejemplo, ciertas células anómalas de una clase celular particular.

Objeto y sumario de la invención La presente invención tiene por lo tanto, como objetivo principal paliar dichos inconvenientes proponiendo un procedimiento que será utilizado en un autómata de análisis de líquido biológico apto para detectar células en el líquido y para determinar una n-tupla que comprende al menos cuatro parámetros físicos (n>3) para cada célula detectada, estando el procedimiento destinado a la clasificación por discriminación... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para ser utilizado en un autómata de análisis de líquido biológico apto para detectar células en el líquido y para determinar una n-tupla (xi (X1...Xn, Ci) ) que comprende al menos cuatro parámetros físicos (n>3) medidos para cada célula detectada, siendo dicho procedimiento para la clasificación por discriminación y para el recuento en un conjunto de al menos tres clases celulares (Ci) y para su representación y que comprende las siguientes etapas:

a) almacenar, previamente, una pluralidad de transformaciones matemáticas (Tn->m) de una pluralidad de n-tuplas en m-tuplas (yj (Y1...Ym, Cj) ) , m<n, cada transformación, asociada a una clasificación particular de los elementos de n-tuplas en un conjunto predeterminado de clases celulares (Cdi) y determinada en función de conocimientos estadísticos sobre las células que constituyen estas clases celulares, que permite colocar las clases celulares (Cdi) de un líquido biológico que presenta las características estadísticas medias en zonas distintas del espacio compuesto de m dimensiones;

b) almacenar, previamente, una pluralidad de filtros de discriminación y de reclasificación (A) en al menos dos clases celulares (Cd1, Cd2) que permiten, en espacios compuestos de m dimensiones, discriminar las m-tuplas de al menos dos clases celulares,

c) almacenar, previamente, para la presentación, al menos una transformación (T->1, 2, 3) de una pluralidad de ntuplas (xi (X1...Xn, Ci) ) en 3-tuplas, 2-tuplas, o 1-tuplas, determinada en función de conocimientos estadísticos sobre las células que constituyen las clases celulares de un líquido biológico normal, que permite colocar las clases celulares (Cdi) de un líquido biológico que presenta las características estadísticas medias en zonas distintas del espacio de 3 dimensiones, de superficie de 2 dimensiones, o del eje de una dimensión;

d) recibir una pluralidad de n-tuplas (xi (X1...Xn, Ci) ) , como resultados del análisis de un líquido biológico;

e) asociar una primera clasificación arbitraria (Csi) a las n-tuplas recibidas;

f) seleccionar un subconjunto de las n-tuplas en función de sus clases (Csi) ;

g) seleccionar y aplicar una transformación (Tn->m) en m-tuplas a las n-tuplas seleccionadas;

h) seleccionar y aplicar un filtro de discriminación (A) a las m-tuplas, lo que conlleva la actualización de las clases (Cdi) de las n-tuplas;

i) reiterar las etapas f) , g) y h) seleccionando un subconjunto de n-tuplas (Csi) y/o una transformación distinta de la anterior y/o un filtro distinto del anterior, definiendo cada iteración un paso de un algoritmo de discriminación, estando este algoritmo definido por la serie de las aplicaciones de transformaciones y de filtros;

j) seleccionar un subconjunto de las n-tuplas a mostrar, en m-tuplas, en función de sus clases;

k) aplicar una etiqueta de presentación particular (COLk) a las n-tuplas en función de su clase (Ck) ;

l) aplicar una transformación en 3-tuplas o 2-tuplas a las n-tuplas, o incluso en 1-tuplas (Tn-> 1, 2, 3) a las n-tuplas seleccionadas;

m) mostrar el resultado de la transformación en 3-tuplas o 2-tuplas en una pantalla (18) , o cualquier otro soporte de presentación, estando cada clase celular discriminada representada por una nube bidimensional o tridimensional dinámica de puntos que llevan etiquetas.

2. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los parámetros físicos son RES, FSC, FL1, SSC.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la transformación de n-tuplas en 2-tuplas asocia a cada célula un vector compuesto de la forma Y1=C11.FSC + C12.SSC + C13.FL1 + C14.RES + C15 e Y2 = C21.FSC + C22.SSC + C23.FL1 + C24.RES + C25.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos ciertos pasos del algoritmo de discriminación se repiten para afinar la discriminación.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una etapa de almacenamiento de una transformación llamada de patología de una pluralidad de n-tuplas en m-tuplas, m<n, asociada a una clasificación particular de un conjunto predeterminado de clases celulares reveladoras de la patología y determinada en función de conocimientos estadísticos sobre las células que constituyen estas clases celulares, que permite colocar las clases celulares de un líquido biológico que presenta las características

estadísticas medias de la patología en zonas distintas del espacio compuesto de m dimensiones, permitiendo, la transformación de patología, disociar un líquido biológico normal de un líquido biológico que presenta una patología particular.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la transformación de las ntuplas en 2-tuplas permite colocar las clases celulares de un líquido biológico que presenta las características estadísticas medias de la patología en zonas distintas del espacio compuesto de 2 dimensiones.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la transformación hacia un espacio bidimensional es tal que las clases celulares se clasifican por grado de madurez.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la transformación de las n-tuplas en 3-tuplas permite colocar las clases celulares de un líquido biológico que presenta las características estadísticas medias de la patología en zonas distintas de un espacio compuesto de 3 dimensiones dinámico en la presentación.

9. Dispositivo de clasificación mediante discriminación y recuento en un conjunto de al menos tres clases celulares que se conectará a un autómata de análisis de líquido biológico apto para detectar células en el líquido y apto para determinar una n-tupla que comprende al menos cuatro parámetros físicos (n>3) para cada célula detectada, comprendiendo dicho dispositivo:

• una memoria para almacenar:

-una pluralidad de transformaciones matemáticas de una pluralidad de n-tuplas en m-tuplas, m<n, cada transformación, asociada a una clasificación particular de un conjunto predeterminado de clases celulares y determinada en función de conocimientos estadísticos sobre las células que constituyen estas clases celulares, que permite colocar las clases celulares de un líquido biológico que presenta las características estadísticas medias en zonas distintas del espacio compuesto de m dimensiones;

- una pluralidad de filtros de discriminación y de reclasificación en al menos dos clases celulares que permiten, en espacios compuestos de m dimensiones, discriminar las m-tuplas de al menos dos clases celulares,

- para la presentación, al menos una transformación de una pluralidad de n-tuplas en 3-tuplas, 2-tuplas, o 1-tuplas, determinada en función de conocimientos estadísticos sobre las células que constituyen las clases celulares de un líquido biológico normal, que permite colocar las clases celulares de un líquido biológico que presenta las características estadísticas medias en zonas distintas del espacio de 3 dimensiones, de la superficie de 2 dimensiones, o del eje de una dimensión;

• medios de recepción de una pluralidad de n-tuplas como resultados del análisis de un líquido biológico;

• medios para asociar una primera clasificación arbitraria a cada n-tupla,

• medios para seleccionar un subconjunto de las n-tuplas en función de sus clases;

• medios de selección de al menos una transformación entre la pluralidad de transformaciones y de al menos un filtro de discriminación entre la pluralidad de los filtros de discriminación;

• medios de procesamiento de datos para aplicar al menos la transformación seleccionada y el filtro de discriminación a las n-tuplas seleccionadas y reiterar estas aplicaciones;

• medios de selección de un sub-conjunto de las n-tuplas a mostrar, en m-tuplas, en función de sus clases

• medios de procesamiento de datos para asociar una etiqueta particular a las m-tuplas según su clase;

• medios de procesamiento de datos para aplicar la transformación de la pluralidad de n-tuplas en 3-tuplas, 2-tuplas,

o 1-tuplas;

- medios para mostrar el resultado de la transformación en 3-tuplas, 2-tuplas, o 1-tuplas en una pantalla.

10. Programa informático que será empleado por un ordenador, un medio de procesamiento de tipo material, tal como un field programmable gate array, o cualquier otro tipo de elemento electrónico programable, que comprende instrucciones para la ejecución de las etapas del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, cuando dicho programa es ejecutado por un ordenador.

11. Soporte de grabación legible por un ordenador en que está grabado un programa informático que comprende instrucciones para la ejecución de las etapas del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.