Citómetro.

Citómetro de flujo configurado para formar una gota que contiene un número predeterminado de dos o más partículas que comprende:

(a) unos medios (38) para desplazar partículas en una corriente de flujo de líquido (35) procedente de una fuente de líquido (34);

(b) unos medios detectores o analizadores (46) aptos para detectar o analizar las partículas de la corriente de flujo;

(c) una ruta de residuos (39) dispuesta aguas abajo de los medios detectores o analizadores para la recepción de residuos líquidos;

(d) una ruta de recogida (41) dispuesta aguas abajo de los medios detectores o analizadores para la recepción de 10 líquidos de recogida que contienen las partículas pretendidas;

(e) una boquilla para gotículas (70) que presenta una abertura de salida definida para dispensar una gota de un volumen definido que contiene un número predeterminado de dos o más partículas de la ruta de recogida; y

(f) unos medios de control (42) para dirigir la corriente de líquido hacia la ruta de residuos o la ruta de recogida.

Citómetro

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a citómetros modificados y, en particular, a citómetros que permiten formar y recoger gotas de líquido que contienen un número predeterminado de partículas.

ANTECEDENTES

La citometría de flujo se utiliza para medir cuantitativamente las características físicas o químicas de las partículas de muestras líquidas tal como se presentan en un haz de luz enfocado. Normalmente, ello se realiza enfocando el haz de luz, generado por una lámpara de vapor de mercurio o un láser, en un flujo continuo de líquido, conocido como líquido envolvente, que contiene muestras de partículas que se inyectan en el líquido envolvente como como flujo laminar estrecho. El líquido envolvente pasa a través de una celda de flujo en la que se canaliza en un flujo fino comprendido normalmente entre 50 y 250 μm de diámetro. El haz de luz se enfocado en la corriente mientras se encuentra dentro de una zona de cuarzo de la celda de flujo o bien una vez el flujo ha salido de la celda de flujo. Ello se conoce como análisis "en cuarzo" o análisis "en aire", respectivamente. El punto en el que la luz / láser toca la corriente se conoce como zona de interacción.

A medida que las partículas pasan a través de la celda de flujo, entran en el haz de luz y dispersan la luz. La óptica de captación dirige la luz dispersada por las partículas y la luz de fluorescencia emitida por las partículas hacia diversos detectores de luz. Todas estas mediciones de la dispersión de la luz y de la fluorescencia se pueden realizar simultáneamente en una sola partícula. Los datos para cada parámetro se envían normalmente en tiempo real desde el citómetro de flujo a un ordenador.

La velocidad del flujo de líquido a través del haz enfocado es por lo general aproximadamente de 10 ms-1 lo que permite analizar un máximo de aproximadamente de 2.000 a 10.000 células o partículas por segundo.

Además del análisis de citometría de flujo descrito anteriormente, la citometría de flujo se puede utilizar para clasificar células físicamente, utilizando la información de diversos detectores como discriminadores. La clasificación permite la purificación de un tipo de célula particular a partir de una mezcla. El método estándar de clasificación celular por citometría de flujo se conoce como clasificación por desviación de gotículas. Se basa en la utilización de un transductor piezoeléctrico en la celda de flujo para crear gotículas de líquido envolvente. Se pasa corriente eléctrica alterna a través del transductor, lo que provoca que la celda de flujo vibre hacia arriba y hacia abajo en la misma frecuencia que la corriente. La vibración de la celda de flujo provoca que se formen ondulaciones en el líquido envolvente una vez ha abandonado la celda de flujo. A medida que la corriente se aleja de la celda de flujo, las ondulaciones de la corriente de líquido envolvente se vuelven cada vez más definidas, hasta que se rompe la corriente en gotículas. La última ondulación en la corriente antes de que la corriente se rompa en gotículas se conoce como última gotícula retenida.

Si se va a recoger una partícula, se dispone una carga eléctrica en el líquido envolvente en el momento exacto en que la partícula se encuentra en la última gotícula retenida. La carga se produce durante mientras dura una vibración del cristal piezoeléctrico del transductor. Con ello se produce una única gotícula, que contiene la partícula a clasificar, cargándose. Al circular desde la celda de flujo, la circulación de gotículas pasa entre dos placas, una con carga positiva y una con carga negativa. Cuando la gotícula cargada pasa entre las placas, se desvía de la corriente principal de las gotículas, lo que permite recoger las mismas. Dicho procedimiento de clasificación se puede realizar a una velocidad de varios miles de veces por segundo utilizando un citómetro actual.

Sin embargo, los citómetros de flujo que utilizan la clasificación por desviación de gotículas son instrumentos sofisticados que requieren, por lo menos, que un usuario muy experto los alinee diariamente. La configuración de la clasificación resulta asimismo difícil y requiere diversas calibraciones, entre ellas calcular el período tiempo que tarda una partícula para viajar desde la zona de interacción hasta la última gotícula retenida. Dicho período de tiempo se conoce como retardo de las gotículas. Una vez se ha configurado la clasificación, se debe controlar atentamente para garantizar que no cambia el retardo de la gotícula.

Una limitación de la clasificación por desviación de la gotícula es que no permite crear gotículas que contengan más de una partícula. Un problema adicional con la clasificación por desviación de la gotícula es que puede crear aerosoles y, por lo tanto, no es apta para analizar muestras biológicamente peligrosas. Las dificultades con la utilización de la clasificación por retardo de la gotícula han limitado el uso de la tecnología a los laboratorios de investigación especializados.

Un modo alternativo de clasificación mediante citometría de flujo se describe en el documento US n.º 5.030.002 "Método y aparato para clasificar partículas con un tubo de captura móvil". Dicho procedimiento de clasificación utiliza un tubo de captura que se mueve mecánicamente dentro y fuera de la corriente de muestra para capturar una partícula. El citómetro se realiza a partir de un alojamiento que presenta una parte superior y una parte inferior, que se conforma para formar una boquilla. La parte inferior del alojamiento se acopla a un recipiente que contiene un líquido de muestra a analizar. En su utilización, el líquido de muestra se bombea hacia el alojamiento a través de un tubo utilizando una bomba. Además, el alojamiento se conecta a una fuente de líquido envolvente, que se bombea hacia el alojamiento a lo largo de un tubo utilizando una bomba. La parte superior del alojamiento se conecta a través de un tubo a un recipiente de residuos para capturar el líquido envolvente residual. La parte superior del alojamiento se adaptada para alojar un tubo de captura. El tubo de captura es móvil entre unas posiciones primera y segunda mediante un accionador, tal como un solenoide o similar. El tubo de captura se acopla a través de un conducto de silicona hasta un recipiente que recoge la muestra producida en una corriente de líquido. Para poder analizar el líquido de muestra, el citómetro comprende un sistema de detección constituido sustancialmente a partir de una fuente de radiación tal como un láser y uno o más detectores. El sistema de detección se adapta para detectar propiedades de las partículas que circulan a través de una zona de interacción. En su utilización, el sistema funciona para analizar las partículas individuales contenidas en el líquido de muestra. Ello se realiza bombeando el líquido de muestra por el tubo hasta el alojamiento. Simultáneamente, el líquido envolvente se bombea hacia el alojamiento a través del tubo. El líquido envolvente se bombea hacia el alojamiento a presión para generar una corriente de líquido enfocada que rodee el líquido de muestra. Al impulsar el líquido envolvente y el líquido de muestra a través de la boquilla, ello provoca que el líquido de muestra forme una corriente fina que contiene una corriente laminar de partículas individuales de la muestra. Al pasar las partículas de muestra a través de la zona de interacción, el sistema de detección funciona para analizar una o más propiedades de cada célula o partícula. A continuación se transfiere una señal mediante un sistema de control hacia el accionador para controlar la posición del tubo de captura. En su utilización, cuando el tubo de captura se encuentra en una primera posición, las partículas contenidas en la corriente laminar se dirigen a través del tubo de captura a un recipiente de recogida. Cuando el tubo de captura se encuentra en una segunda posición, la corriente laminar que contiene partículas se dirige hacia el recipiente de residuos. Por consiguiente, ello permite que el sistema clasifique las partículas detectando determinadas propiedades de las partículas y a continuación dirigiendo las partículas en un recipiente de recogida o en el recipiente de residuos.

En muchos casos, sin embargo, se pretende poder producir unas cantidades predeterminadas y, en particular, una concentración predeterminada de partículas en una muestra y ello generalmente no resulta posible con esta disposición. En particular, incluso cuando se dispone el accionador en la segunda posición, el líquido envolvente se transmite todavía a través del tubo de captura y el conducto hacia el recipiente de recogida. Por consiguiente, resulta... [Seguir leyendo]

1. Citómetro de flujo configurado para formar una gota que contiene un número predeterminado de dos o más partículas que comprende:

(a) unos medios (38) para desplazar partículas en una corriente de flujo de líquido (35) procedente de una fuente de líquido (34) ;

(b) unos medios detectores o analizadores (46) aptos para detectar o analizar las partículas de la corriente de flujo;

(c) una ruta de residuos (39) dispuesta aguas abajo de los medios detectores o analizadores para la recepción de residuos líquidos;

(d) una ruta de recogida (41) dispuesta aguas abajo de los medios detectores o analizadores para la recepción de líquidos de recogida que contienen las partículas pretendidas;

(e) una boquilla para gotículas (70) que presenta una abertura de salida definida para dispensar una gota de un volumen definido que contiene un número predeterminado de dos o más partículas de la ruta de recogida; y

(f) unos medios de control (42) para dirigir la corriente de líquido hacia la ruta de residuos o la ruta de recogida.

2. Citómetro según la reivindicación 1, en el que los medios para desplazar las partículas en una corriente de flujo líquido son una bomba (38) .

3. Citómetro según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que los medios detectores o analizadores comprenden:

(i) unos medios (46A) para proporcionar un haz de luz para iluminar las partículas de la corriente de flujo de líquido;

(ii) unos medios (46B) para detectar la luz con respecto a cada partícula en movimiento y para asociar la luz detectada a una o más características de cada partícula y generar una señal correspondiente a la característica de la partícula (s) ; y

(iii) unos medios para recibir la señal.

4. Citómetro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la ruta de residuos comprende un tubo de residuos (39) dirigido a un sitio de recogida de residuos (40) .

5. Citómetro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la ruta de recogida comprende un tubo de captura (41) que presenta un volumen definido.

6. Citómetro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que la ruta de recogida comprende un tubo de captura (41) y un tubo de recogida (60) que presenta un volumen definido que pasa desde el tubo de captura.

7. Citómetro según la reivindicación 6, en el que la boquilla para gotículas se puede disponer sustancialmente en un extremo del tubo de captura (41) .

8. Citómetro según la reivindicación 6, en el que la boquilla para gotículas se puede disponer sustancialmente en un extremo del tubo de recogida (60) .

9. Citómetro según la reivindicación 8, que comprende además una fuente secundaria de muestras (80) que puede añadir líquido a la boquilla para gotículas.

10. Citómetro según la reivindicación 9, en el que la fuente secundaria de muestras (80) se añade a la boquilla para gotículas (70) mediante unos medios de bombeo (86) .

11. Citómetro de flujo según la reivindicación 1, configurado para formar una gota que contiene un número predeterminado de dos o más partículas que comprende:

(a) una fuente de líquido (34) para generar una corriente de líquido que contiene partículas;

(b) un sistema de detección (46) para detectar una o más propiedades de una partícula contenida en la corriente de líquido;

(c) un tubo de captura (41) apto para recoger un número predeterminado de partículas y dirigir las partículas hacia una salida en un volumen predeterminado de líquido, presentando el tubo de captura (41) una entrada para recibir selectivamente partículas de la corriente de líquido, pudiendo desplazarse el tubo de captura entre:

(i) una primera posición en la que las partículas contenidas en la corriente de líquido se reciben en la entrada y se dirigen hacia la salida, y

(ii) una segunda posición en la que las partículas no se reciben en la entrada;

(d) un sistema de control (42) para controlar la posición del tubo de captura (41) según las señales recibidas desde el sistema de detección (46) para de este modo provocar la recogida del número predeterminado de partículas;

(e) una boquilla para gotículas (70) que presenta una abertura de salida definida para dispensar una gota que contiene el número predeterminado de dos o más partículas de la ruta de recogida; y (f) un selector para seleccionar las gotas de líquido que se presentan en la salida según las señales recibidas desde el sistema de detección.

12. Citómetro según la reivindicación 11 que comprende además un sensor (50) para detectar la salida de cada gota de la salida, siendo asimismo el selector apto para recoger selectivamente las gotas según las señales recibidas del sensor.

13. Citómetro según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, que comprende o es apto además para cooperar con, un sistema de procesamiento acoplado al sistema de detección (46) , el sistema de control (42) , el sensor (50) y el selector, siendo el sistema de procesamiento apto para:

(i) realizar el seguimiento de la salida de una gota de líquido de la salida del tubo de captura (41) utilizando el sensor (50) ;

(ii) provocar que el sistema de control (42) desplace el tubo de captura (41) hasta la primera posición para de este modo dirigir una partícula que presenta las propiedades seleccionadas hacia el tubo de captura (41) ;

(iii) repetir (ii) hasta que un número predeterminado de partículas se ha dirigido hacia el tubo de captura (41) ;

(iv) controlar la duración de (ii) y (iii) para garantizar de ese modo que el número predeterminado de partículas se encuentra contenido en una única gota de líquido;

(v) realizar el seguimiento de la salida de la gota de líquido de la salida del tubo de captura utilizando el sensor; y

(vi) provocar que el selector seleccione la gota de líquido.

14. Citómetro según las reivindicación 12, en el que el selector comprende:

(a) un brazo colector (52) ;

(b) un controlador para controlar la posición del brazo colector (52) , siendo el brazo colector apto para desplazarse entre:

(i) una primera posición en la que las gotas de líquido se recogen mediante el brazo colector (52) ; y

(ii) una segunda posición en la que las gotas de líquido no se recogen mediante el colector.

15. Citómetro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la boquilla para gotículas (70) se puede disponer sustancialmente en un extremo del tubo de captura (41) aguas abajo del detector o analizador (46) .

16. Citómetro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que puede comprender además unos medios de captura de gotículas que pueden eliminar las gotas formadas por la boquilla para gotículas (70) .

17. Citómetro según las reivindicación 16, en el que los medios de captura de las gotículas son una bomba de vacío dispuesta adyacente a la boquilla para gotículas.

18. Citómetro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que puede formar una gota que presenta un volumen comprendido entre 1 μl y 500 μl; preferentemente entre 20 μl y 100 μl; y más preferentemente de aproximadamente 30 μl.

19. Método para obtener una gota de líquido que presenta un número predeterminado de dos o más partículas de un tipo pretendido, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un citómetro según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18;

(b) proporcionar una muestra que contenga partículas de la corriente de líquido;

(c) detectar o analizar las partículas en la corriente de líquido;

(d) dirigir un tipo pretendido de partícula hacia la ruta de recogida en un líquido de recogida;

(e) pasar el líquido de recogida que contiene el tipo pretendido de partículas a través de la boquilla para gotículas; y

(f) recoger el número predeterminado de dos o más partículas de un tipo pretendido en una gota.