Circuito para la fijación de voltajes en los electrodos de dentro de cámaras CHEF de sistemas de electroforesis en gel de campo pulsado.

Circuito para imponer los voltajes en los electrodos de las cubetas del sistema chef de electroforesis DE CAMPOS PULSANTES RESUMEN.

Circuito para imponer los voltajes en los electrodos de las cubetas del sistema CHEF de electroforesis de campos pulsantes (ECP) que está formado por dos circuitos de imposición idénticos que se conectan a una fuente de poder a través de un alternador de forma que solo uno de los dos circuitos de imposición reciba energía eléctrica a la vez. Cada circuito de imposición está formado por varias resistencias y diodos conectados en serie para formar un divisor de voltajes. A los nodos formados en la unión de dos resistencias se conectan repetidores de voltajes. Cada repetidor se conecta a una pareja de electrodos que deben ser polarizados al mismo potencial. Se introducen diodos para corregir pequeños errores en el patrón de voltaje aplicado a los electrodos. El circuito es capaz de mantener el potencial de cada electrodo frente a las variaciones de conductividad que ocurren en la cubeta durante la electroforesis. De esta forma cada circuito de imposición genera un campo eléctrico homogéneo de igual valor y dirección diferente en una cubeta de ECP del sistema CHEF. Cubetas con diferente número, disposición y separación entre los electrodos pueden ser polarizadas con este circuito.

Circuito para la fijación de voltajes en los electrodos de dentro de cámaras CHEF de sistemas de electroforesis en gel de campo pulsado REFERENCIA A LA APLICACIÓN RELACIONADA La presente invención se refiere a equipos eléctricos usados en electroforesis, específicamente, a la generación de potenciales eléctricos de contornos limitados para generar campos homogéneos que alternan su dirección de aplicación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La electroforesis La electroforesis es una técnica que separa las moléculas por su migración diferencial en el interior de un campo eléctrico. Las moléculas pueden ser colocadas en un gel y pasadas por un tamiz cuando se aplica el campo eléctrico que las obliga a migrar. Las moléculas cargadas negativamente migran hacia el ánodo y las cargadas positivamente migran hacia el cátodo. De esta manera, las moléculas son separadas en bandas en el interior del gel, en función de su tamaño. Normalmente, hay dos electrodos paralelos dispuestos para la generación del campo eléctrico; están conectados a las salidas positiva y negativa de una fuente de alimentación.

Las moléculas de ADN se cargan negativamente cuando son disueltas en tampón a pH neutro o alcalino. Cuando se aplica el campo eléctrico, las moléculas de ADN se alargan y su relación carga-masa se hace independiente de su tamaño molecular. Las razones indicadas anteriormente, junto con el hecho de que las moléculas de ADN migran a través de los poros del gel de una manera similar al movimiento de una serpiente, es decir, por medio de un mecanismo de reptación, se determina que las moléculas que tienen más de 20.000 pares de bases no pueden ser separadas en la electroforesis en campo eléctrico constante, incluso cuando son sometidas a tamizado molecular.

Electroforesis en gel de campo pulsado La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) fue creada por Schwartz y Cantor en 1984 (Cell, 37, pp 67-75, 1984, patente US 4.473.452, 25 de septiembre, 1984) y aumentó la gama de moléculas de ADN que podrían ser separadas en la electroforesis. Los autores encontraron que las grandes moléculas de ADN intactas, de más de 20.000 pares de bases, se separaban en patrones de bandas en el interior de geles de agarosa por medio de la aplicación de pulsos eléctricos de duración seleccionada que alternaban periódicamente su dirección de aplicación con relación al gel de separación. Los cambios en la dirección de la aplicación del campo eléctrico causan la reorientación de la migración de las moléculas de ADN, mientras que la duración de esta reorientación depende del tamaño molecular. Los patrones de bandas resultantes han sido denominados "patrones electroforéticos”, “cariotipos moleculares”, “cariotipos electroforéticos”, etc.

De esta manera, cualquier sistema de electroforesis en gel de campo pulsado consiste en:

1. La cámara de electroforesis con sus accesorios

2. La electrónica apropiada para alternar los campos eléctricos con la intensidad y la duración de pulso deseadas.

3. El procedimiento para polarizar los electrodos.

Los campos eléctricos que se generaban en los equipos de PFGE iniciales, tales como los descritos por Schwartz y Cantor (Cell, 37, pp 67-75, 1984; patente US Nº 4.473.452, 25 de septiembre, 1984) y otros, tales como los descritos por Carle y Olson (Carle G. F., Olson M. V. Nucleic. Acid Res., 12, pp 5647-5664, 1984) ) no ofrecían 50 valores homogéneos de intensidad del campo eléctrico a lo largo del gel, de manera que la trayectoria y la velocidad de migración de las moléculas de ADN en estos geles dependían de la posición que ocupaban en el interior del gel.

Generación de campos eléctricos homogéneos en PFGE

En teoría, dos electrodos infinitos colocados en paralelo y separados cierta distancia generan un campo eléctrico homogéneo. Pero el diseño de dicha cámara de electroforesis es impracticable. Para acercarse a la obtención de un campo eléctrico de intensidad homogénea a lo largo del gel de separación usando electrodos finitos, Chu (Chu G., D. Vollrath, Davis RW Science, 234, pp 1582-1985, 1986) propuso lo siguiente:

1. Se selecciona un polígono regular (cuadrado, rectángulo o hexágono) como un contorno cerrado en cuyos lados se colocarán un conjunto de electrodos para generar en el interior del polígono un campo eléctrico de valores de intensidad homogénea.

2. El eje "X" (y = 0) de un plano cartesiano imaginario se hace coincidir con uno de los lados del polígono regular.

3. Se aplica un potencial de 0 voltios a los electrodos colocados en y = 0

4. Se aplica un potencial de “V0” voltios a los electrodos colocados en el lado opuesto del polígono regular que están a una distancia y = A desde el eje "X".

5. En los electrodos restantes, situados en los otros lados del polígono regular y a una distancia “yi” desde el eje "X", se aplica un potencial de “V (yi) ”, donde V (yi) = V0•yi/A.

6. De esta manera, el potencial generado en el interior del polígono regular es similar al que sería generado 10 por dos electrodos infinitos y paralelos separados una distancia "A" uno del otro.

7. Si la polaridad de los electrodos colocados en dos pares de lados opuestos es intercambiada electrónicamente se formará un ángulo entre las líneas de fuerza de los campos eléctricos resultantes. Este ángulo se denomina en PFGE ”ángulo de reorientación”.

8. El ángulo de reorientación, obtenido cuando la polaridad entre los electrodos de dos pares de lados

diferentes es intercambiada electrónicamente, será de 90º en el cuadrado y de 60º o de 120° en el hexágono.

La configuración de electrodos en un conjunto hexagonal ha sido la usada en los sistemas actuales de PFGE. Ese sistema se denominó campo eléctrico homogéneo de contornos limitados o CHEF (Contour Clamped

Homogeneous Electric Field) y fue introducido por Chu en 1986 (Chu G. Science 234, pp 1582-1585, 16 de diciembre, 1986) .

Una de las deficiencias del sistema CHEF actual es que el contorno cerrado de electrodos está limitado a los polígonos regulares descritos anteriormente.

Procedimientos para fijar los voltajes en los electrodos en el interior de una cámara CHEF y para obtener campos eléctricos de intensidad homogénea en el interior del gel

Principalmente, se han propuesto tres procedimientos, los cuales fueron ganando en complejidad y componentes 30 electrónicos:

1. Un divisor de voltaje sencillo (Chu G., Vollrath D., Davis R. W. Science, 234, pp 1582-1585, 1986) .

2. El divisor de voltaje asociado a unos pares de transistores en configuración push-pull (Maule J., Green D.

K. Anal. Biochem. 191, pp 390-395, 1990) .

3. El uso de amplificadores operacionales para controlar mejor los voltajes impuestos en cada electrodo del sistema CHEF (Clark S.M., Lai E., Birren B.W., Hood L. Science 241, pp 1203-1205, 1988) .

Divisor de voltaje simple en los sistemas de PFGE.

Uno de los procedimientos para fijar los valores de potencial en los electrodos CHEF es mediante el uso de una red

de resistencias que están conectadas en serie. Esta red forma un divisor de voltaje entre los valores de cero y “V0”. Se denominarán nodos a los lugares de unión entre dos resistencias en serie del divisor de voltaje y en cada nodo hay conectado un electrodo del hexágono.

Los electrodos colocados en y = 0 e y = A, es decir, en dos lados opuestos del hexágono, están conectados a los 45 potenciales “0” y “V0”, respectivamente. Hay otros dos grupos de electrodos, los electrodos de dos lados consecutivos del hexágono forman cada grupo. Cada uno de estos electrodos está conectado a un nodo del divisor de voltaje que define el potencial que debería aplicarse en este electrodo. El valor potencial que se impone es calculado tal como se ha indicado en el párrafo anterior. Por esa razón, los dos electrodos que están en dos lados diferentes del hexágono, pero están a la misma distancia “yi” desde los electrodos más electronegativos (y = 0) ,

deberían estar al mismo valor de voltaje determinado por V (yi) = V0•yi/A.

Para conseguir el cambio en la dirección de aplicación del campo eléctrico, lo cual es indispensable en PFGE, la diferencia de potencial es aplicada a otros dos grupos diferentes de electrodos. Esto se lleva a cabo con relés y diodos que conectan los electrodos que deberían estar polarizados con cero voltios y “V0” a las salidas de la fuente 55 de alimentación a través del sistema para la conmutación de los campos eléctricos.... [Seguir leyendo]

1. Circuito para fijar los voltajes en los electrodos de las cámaras de Electroforesis en Gel en Campo Pulsante del Sistema de Campo Eléctrico Homogéneo con Contornos Limitados y para generar dos campos eléctricos homogéneos, de intensidades idénticas pero de orientación diferente, cuando se combina con:

! una fuente de alimentación con salidas positiva y negativa; ! un alternador con dos salidas positivas y dos salidas negativas y ! una cámara de electroforesis llena con una solución tampón, ! una cámara de electroforesis que posee un conjunto de electrodos situados en los “m” lados de un polígono regular que tiene “k” electrodos por lado, donde el lado L1 es seleccionado arbitrariamente y se hace coincidir con el eje “X” de un plano cartesiano, el lado Lm/2+1 es paralelo al lado L1 y los otros lados, denominados lados “C” y “D”, están situados a la izquierda y a la derecha de los lados L1 y Lm/2+1, respectivamente, en el que los electrodos EiC-EiD están separados homogéneamente en cada lado del polígono, existiendo, de esta manera, “n” pares Pi de electrodos EiC-EiD formados por electrodos situados a la misma distancia desde el lado L1, donde “n” es igual a k• (m-2) /2 e “i” es un número natural entre 1 y “n”,

circuito que está formado por

∀ dos circuitos de fijación idénticos y cada circuito establece, de manera independiente, una de las dos posibles orientaciones del campo eléctrico mediante el establecimiento de los potenciales en los electrodos del polígono regular que homogeneizan el campo eléctrico, potenciales en los que los cero voltios corresponden a los electrodos situados en el lado L1, lado L1 que es otro lado del polígono regular cuando el campo eléctrico es conmutado ∀ diodos para conectar los electrodos situados en los lados L1 y Lm/2 +1 a las salidas negativa y positiva de la fuente de alimentación, respectivamente, en cada orientación del campo eléctrico ∀ resistencias y diodos para generar referencias de voltaje en el interior de cada circuito de amortiguación para polarizar los electrodos EiC-EiD de cada par Pi de electrodos ∀ transistores para estabilizar los potenciales en los electrodos EiC-EiD de cada par Pi de electrodos independientemente de los cambios de conductividad de la solución tampón, pero los dos electrodos EiC-EiD de cada par Pi de electrodos son alimentados por un único transistor ∀ pares de diodos para conectar, de manera permanente, los dos electrodos EiC-EiD de cada par Pi de electrodos al mismo nodo de la referencia de voltaje a través de dichos transistores únicos y para polarizar estas dos electrodos EiC-EiD al mismo potencial en una orientación del campo eléctrico, pero para aislar eléctricamente dichos dos electrodos EiC-EiD en la otra orientación del campo ∀ diodos para compensar los errores en el voltaje aplicado a los electrodos ∀ diodos para conectar, de manera permanente, los dos circuitos independientes al mismo conjunto de electrodos.

2. Circuito según la reivindicación 1, que comprende que cada circuito de fijación está conectado a la fuente de alimentación en una manera en la que solo uno de los circuitos de fijación recibe energía eléctrica en cada momento.

3. Circuito según la reivindicación 1, que comprende que cada electrodo situado en el lado L1 está conectado al ánodo de un diodo, los cátodos de estos diodos están unidos entre sí y conectados al ánodo de un segundo diodo y el cátodo de este segundo diodo está conectado a la salida negativa de la fuente de alimentación.

4. Circuito según la reivindicación 1, que comprende que cada electrodo situado en el lado Lm/2+1 está conectado al cátodo de un diodo, los ánodos de estos diodos están unidos entre sí y están conectados al cátodo de un segundo diodo y el ánodo de este segundo diodo está conectado a la salida positiva de la fuente de alimentación.

5. Circuito según la reivindicación 1, que comprende que esas resistencias y diodos para generar referencias de voltaje forman un divisor de voltaje realizado con “n+1” resistencias Ri y hasta diez diodos conectados a través de las salidas positiva y negativa de la fuente de alimentación, donde “n” es igual a k• (m-2) /2.

6. Circuito según la reivindicación 1, que comprende que dicho único transistor está en una configuración seguidor de emisor, su base está conectada a uno de los nodos de la referencia de voltaje, su emisor al par Pi de electrodos correspondiente a través de un par de diodos, un transistor que es de un tipo PNP, con su colector conectado a la salida negativa de la fuente de alimentación cuando “i” es un número natural entre 1 y n/2 y es un transistor de tipo NPN, con su colector conectado a la salida positiva de la fuente de alimentación cuando “i” es un número natural entre [ (n/2) +1] y n.

7. Circuito según la reivindicación 1, que comprende que cada par de diodos está formado por dos diodos cuyos cátodos están conectados al emisor del transistor correspondiente y cuyos ánodos están conectados a los dos electrodos del par Pi de electrodos correspondiente, cuando “i” es un número natural entre 1 y n/2.

8. Circuito según la reivindicación 1, que comprende que cada par de diodos está formado por dos diodos cuyos ánodos están conectados al emisor del transistor correspondiente y cuyos cátodos están conectados a los dos electrodos del par Pi de electrodos correspondiente, cuando “i” es un número natural entre