Cepa neurovirulenta del virus West-Nile y sus aplicaciones.
Cepa aislada del virus West-Nile, caracterizada porque su genoma está constituido por la secuencia SEC ID Nº
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2002/001168.
Solicitante: INSTITUT PASTEUR.
Nacionalidad solicitante: Francia.
Dirección: 28, RUE DU DOCTEUR ROUX 75724 PARIS CEDEX 15 FRANCIA.
Inventor/es: FLAMAND, MARIE, DESPRES, PHILIPPE, DEUBEL, VINCENT, GUENET,JEAN-LOUIS, DROUET,MARIE-THERESE,INSTITUT PASTEUR, MALKINSON,MERTYN,KIMRON VETERINARY INSTITUTE, BANET,CAROLINE,KIMRON VETERINARY INSTITUTE, FRENKIEL,MARIE-PASCALE, COURAGEOT,MARIE-PIERRE, COULIBALY,FASSELI, CATTEAU,ADELINE, WEBER,PATRICK, CECCALDI,PIERRE-EMMANUEL.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K39/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
- C07K14/18 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Togaviridae, p. ej. Flavivirus, virus de la peste, virus de la fiebre amarilla, virus de la hepatitis C, virus de la encefalitis japonesa.
- C07K16/10 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › de virus ARN.
- C12N7/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Virus, p. ej. bacteriófagos; Composiciones que los contienen; Su preparación o purificación (preparaciones de uso médico que contienen virus A61K 35/76; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos virales, p. ej. vacunas virales, A61K 39/00).
PDF original: ES-2327217_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Cepa neurovirulenta del virus West-Nile y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a una cepa neuroinvasiva y neurovirulenta del virus West-Nile (o virus del Nilo Occidental), denominada IS-98-ST1, a moléculas de ácido nucleico procedentes de su genoma, a las proteínas y péptidos codificadas por dichas moléculas de ácido nucleico así como a sus aplicaciones.
La presente invención también se refiere a todas las variantes de la cepa viral IS-98-ST1 que tienen al menos una mutación en la secuencia nucleica correspondiente a NS5.
La familia de los Flaviviridae agrupa a los virus del género flavivirus responsables de patologías humanas graves tales como el dengue, la fiebre amarilla, encefalitis trasmitidas por las garrapatas, encefalitis japonesa, encefalitis del Nilo Occidental y los virus de las hepatitis C y G. Aunque los flavivirus pueden provocar una morbilidad y una mortalidad importantes en el ser humano, la infección es generalmente asintomática y solamente una fracción de los individuos infectados desarrolla una enfermedad grave.
Los flavivirus son pequeños virus con envuelta. Su genoma es una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva de aproximadamente 11.000 bases. El ARN genómico se asocia a varias copias de la proteína de la cápsida C para formar la nucleocápsida; ésta está rodeada por una envuelta viral constituida por una bicapa lipídica procedente de las membranas del retículo endoplasmático (RE) en las que están ancladas la proteína de la envuelta E y la proteína de membrana M. El ARN genómico de los flavivirus contiene un único marco abierto de lectura de aproximadamente 10.500 nucleótidos flanqueado por dos regiones cortas no codificantes en sus extremos 5' y 3'. El genoma se traduce a una poliproteína de aproximadamente 3400 aminoácidos que es el precursor de las proteínas estructurales C, prM (el precursor intracelular de M) y E en su parte N-terminal y de al menos siete proteínas no estructurales (NS) de NS1 a NS5 en su parte C-terminal.
Hasta hace muy poco, se reconocía al virus West-Nile como un virus poco patógeno, responsable de un síndrome gripal y presente en África, en el sur de Europa y en Oriente Medio; se ha aislado en el transcurso de epidemias, ocurridas particularmente en Israel en los años 1950 y en Sudáfrica en los años 1970.
Muy recientemente, la epidemiología del virus West-Nile se ha modificado y se ha observado un número creciente de casos de encefalitis en el transcurso de las epidemias ocurridas en Rumanía en 1996, en Israel en 1998 y en los EEUU en 1999.
Se han aislado cepas patógenas durante estas epidemias (Anderson et al., y Lanciotti et al., Science, 1999, 286: 2331-2333, 2333-2337), en particular la cepa NY1999 (GenBank Nº AF202541, Lanciotti et al., mencionado anteriormente), cuya patogenicidad se correlacionará con la presencia de un sitio de glucosilación NTS en la proteína de la envuelta E (Jordan et al., Viral Immunol., 2000, 13, 4: 435-446).
Los factores virales mal identificados podrían ser responsables de la gravedad de la infección, mientras que la constitución genética del huésped (humano o no humano) contribuiría a la resistencia a la infección.
Sin embargo, los datos relativos a estas cepas patógenas aisladas recientemente no permitieron determinar todos los factores virales y los genes del huésped implicados en la sensibilidad/resistencia a la infección por los Flaviviridae.
Los modelos murinos permitieron establecer la existencia de una resistencia genética a la infección por los flavivirus. Se ha demostrado que algunas líneas de ratón recientemente derivadas del estado silvestre y que pertenecen a las especies Mus musculus musculus o Mus spretus (Det, BSVR, BRVR, PRI, CASA/Rk y CAST/Ei) son resistentes a la infección por los flavivirus, mientras que las líneas consanguíneas de laboratorio más habituales que derivan mayoritariamente de la especie Mus musculus domesticus, no la resisten (Sangster et al., J. Virol., 1993, 67: 340-347).
La resistencia está controlada por al menos un locus autosómico denominado Flv, localizado en el cromosoma 5, en el ratón y tres alelos Flvs, Flvr y Flvmr otorgan respectivamente la sensibilidad, la resistencia y la resistencia intermedia a la infección por los flavivirus. Utilizando una cepa del flavivirus de la encefalitis del Valle de Murray y de ratones procedentes del retrocruzamiento de la línea de ratón resistente C3H/RV con las líneas de ratón sensibles C3/He o BALB/c, el locus Flv se localizó en una región de 0,9 cM del cromosoma 5, en el ratón, entre los marcadores D5Mit68 y D5Mit242 (G.R. Shellam et al., Rev. Sci. Tech. Off. Epiz. 1998, 17: 231-248.).
Los Inventores han aislado ahora una nueva cepa del virus West-Nile, a partir de muestras extraídas de cigüeñas en Israel (en la ciudad de Eilat) en septiembre de 1998, que se ha seleccionado para el estudio de la resistencia/sensibilidad de un huésped (mamífero humano o no humano) a la infección por los virus de la familia de los Flaviviridae.
De acuerdo con la invención, dicha cepa neurovirulenta y neuroinvasiva del virus West-Nile aislada, denominada IS-98-ST1, se caracteriza porque su genoma está constituido por la secuencia SEC ID Nº 1 que codifica una poliproteína que presenta la secuencia SEC ID Nº 2.
Los Inventores demostraron particularmente que los ratones de laboratorio son extremadamente sensibles a la infección por la cepa IS-98-ST1 mientras que los ratones de las líneas SEG, WMP, STF y MAI que derivan de ratones silvestres que pertenecen a especies diferentes aunque del mismo género Mus, son completamente resistentes a la infección por esta cepa; una inoculación por vía intraperitoneal de 1000 UFF (Unidades Formadoras de Focos; UFF: DL50 = 100) es mortal al 100% para los ratones de laboratorio, mientras que los ratones silvestres no presentan ningún síntoma; además, el virus se replica en estos ratones, como muestra la aparición de anticuerpos séricos específicos.
La presente invención también se refiere a reactivos, derivados de la cepa IS-98-ST1, utilizados para el estudio y el diagnóstico de las infecciones por Flaviviridae, reactivos que se seleccionan entre el grupo constituido por los siguientes reactivos:
Estos diferentes reactivos se preparan y utilizan de acuerdo con técnicas clásicas de biología molecular y de inmunología, siguiendo los protocolos convencionales tales como los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc, Library of Congress, EEUU) y en Current Protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress. EEUU).
Los fragmentos de ácidos nucleicos tales como los definidos anteriormente, en particular los correspondientes a las secuencias SEC ID Nº 3-11 se utilizan... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Cepa aislada del virus West-Nile, caracterizada porque su genoma está constituido por la secuencia SEC ID Nº 1.
2. Molécula de ácido nucleico, caracterizada porque se selecciona entre el grupo constituido por la secuencia SEC ID Nº 1 y la secuencia complementaria anti-sentido de la secuencia SEC ID Nº 1.
3. Fragmento de la molécula de ácido nucleico de secuencia SEC ID Nº 1, caracterizado porque se selecciona entre el grupo constituido por los cebadores que comprenden al menos 15 nucleótidos de la secuencia cadena arriba o cadena abajo de uno de los codones correspondientes a las siguientes posiciones en la secuencia nucleotídica SEC ID Nº 1:
4. Fragmento de la molécula de ácido nucleico de secuencia SEC ID Nº 1, caracterizado porque se selecciona entre el grupo constituido por los fragmentos, preferiblemente entre 50 y 200 nucleótidos, amplificados utilizando los cebadores de acuerdo con la reivindicación 3.
5. Vector recombinante, caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
6. Célula eucariota, aislada caracterizada porque se transforma con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, un vector de acuerdo con la reivindicación 5 o una cepa neurovirulenta del virus West-Nile de acuerdo con la reivindicación 1.
7. Proteína o péptido, caracterizado porque está codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
8. Utilización de la cepa de acuerdo con la reivindicación 1, para la obtención de un anticuerpo policlonal, mediante inmunización de un mamífero no humano.
9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque dicho mamífero no humano es un ratón homocigótico para el alelo Flvr de resistencia a la infección por los virus de la familia de los Flaviviridae.
10. Utilización de un vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 o bien de una proteína o de un péptido, de acuerdo con la reivindicación 7, para la obtención de un anticuerpo policlonal o monoclonal mediante inmunización de un mamífero no humano.
11. Modelo de estudio no humano de la sensibilidad/resistencia a la infección por un virus de la familia de los Flaviviridae, caracterizado porque comprende al menos una cepa neurovirulenta del virus West-Nile de acuerdo con la reivindicación 1.
12. Modelo de estudio de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además un ratón homocigótico para el alelo Flvr o Flvs.
13. Procedimiento de detección de una infección por Flaviviridae, particularmente por el virus West Nile, caracterizado porque comprende:
14. Procedimiento de cribado de genes celulares implicados en la resistencia de un mamífero a la infección por un virus de la familia de los Flaviviridae, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
15. Utilización del modelo de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, para la clasificación de moléculas activas contra una infección vírica debida a un virus de la familia de los Flaviviridae.
16. Procedimiento de clasificación de moléculas activas contra una infección por un Flavivirus, caracterizado por:
17. Variante de la cepa viral de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque su genoma comprende al menos una mutación solamente en la secuencia nucleotídica correspondiente a la proteína NS5.
18. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque se selecciona entre el grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº 3-11.
19. Procedimiento de detección de una infección por Flaviviridae particularmente por el virus West Nile, caracterizado porque comprende:
20. Kit de detección de una infección por un flavivirus que comprende al menos:
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