Células madre de tipo embrionario aisladas de sangre de cordón umbilical humano.

Células madre de tipo embrionario aisladas de sangre de cordón umbilical humano caracterizadas por:

(a) mostrar características de células madre embrionarias que comprenden la capacidad de proliferación y la capacidad de diferenciarse a diversos tipos de células, (b) mostrar características de las células hematopoyéticas que comprenden la expresión de CD45; (c) fenotípicamente distintas de linfocitos, macrófagos y monocitos por ser negativas para los marcadores CD3, CD20, CD11b/Mac-1 y CD14; (d) fenotípicamente distintas de las células madre hematopoyéticas por ser negativas para el marcador CD34, (e) mostrar baja inmunogenicidad mediante la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) asociadas con baja inmunogenicidad, y (f) mostrar una regulación inmunitaria por inhibición de la proliferación de linfocitos estimulada por mitógenos, para su uso en la terapia basada en células madre.

Células madre de tipo embrionario aisladas de sangre de cordón umbilical humano Antecedentes de la invención:

Campo de la invención La presente invención se refiere en general a células madre de tipo embrionario aisladas de sangre de cordón umbilical humano, denominadas en la presente memoria células madre de sangre de cordón (CB-SC "del inglés Cord Blood-Stem Cells") , que muestran las características de las células madre embrionarias y las células hematopoyéticas. Estas células tienen capacidad de proliferación y son capaces de diferenciarse a múltiples tipos de células. Además, las CB-SC muestran una baja inmunogenicidad y regulación inmunitaria. En la presente invención, estas células son para su uso en terapias basadas en células madre para el tratamiento de enfermedades tales como la enfermedad de Parkinson, la diabetes, la lesión de la médula espinal, las enfermedades cardiovasculares por esclerosis múltiple (EM) , el accidente cerebrovascular y los defectos de nacimiento.

Antecedentes de la invención La creciente prevalencia de enfermedades humanas crónicas, p. ej., las enfermedades cardiovasculares, la diabetes y las enfermedades degenerativas neuronales, representan un desafío para encontrar terapias más eficaces. La terapia basada en células madre, incluyendo células madre embrionarias y adultas, proporciona una herramienta de tratamiento racional para la medicina regenerativa y tiene el potencial de revolucionar la terapéutica moderna [A. Vats, R. C. Bielby, N. S. Tolley, R. Nerem, J. M. Polak, Stem cells, Lancet 366 (2005) 592-602; M. A. Hussain, N. D. Theise, Stem-cell therapy for diabetes mellitus, Lancet 364 (2004) 203-205; C. M. Rice, N.J. Scolding, Adult stem cells-reprogramming neurological repair? Lancet 364 (2004) 193-199; L. M. Hoffman, M.K. Carpenter, Characterization and culture of human embr y onic stem cells, Nat Biotechnol. 23 (2005) 699-708]. Debido a su alto potencial de autorrenovación y capacidad de diferenciación pluripotente, las células madre embrionarias (ES) se han convertido en un área de investigación muy activa [A. Vats, R. C. Bielby, N. S. Tolley, R. Nerem, J.M. Polak, Stem cells, Lancet 366 (2005) 592-602; L. M. Hoffman, M.K. Carpenter, Characterization and culture of human embr y onic stem cells, Nat Biotechnol. 23 (2005) 699-708; K. H. Wilan, C.T. Scott, S. Herrera, Chasing a cellular fountain of youth, Nat Biotechnol. 23 (2005) 807-815]. Las preocupaciones éticas, sin embargo, han limitado su disponibilidad y utilidad práctica [C. Dennis, Check E, 'Ethical' routes to stem cells highlight political divide, Nature 437 (2005) 10761077; M. Evans, Ethical sourcing of human embr y onic stem cells--rational solutions? Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2005) 663-667]. Dejando de lado estas preocupaciones éticas, la utilización de la fertilización in vitro (FIV) y la transferencia nuclear alterada (TNA) para generar células ES se hace problemática por la complejidad de las tecnologías requeridas [M. Evans, Ethical sourcing of human embr y onic stem cells--rational solutions? Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2005) 663-667; D. A. Melton, G. Q. Daley, C. G. Jennings, Altered nuclear transfer in stem-cell research a flawed proposal, N Engl J Med. 351 (2004) 2791-2792].

Recientemente, se ha utilizado la sangre del cordón umbilical humano como una fuente de células madre para repoblar el sistema hematopoyético y otros órganos [J. Bonde, D. A. Hess, J. A. Nolta, Recent advances in hematopoietic stem cell biology, Curr Opin Hematol. 11 (2004) 392-398; K. K. Ballen, New trends in umbilical cord blood transplantation, Blood 105 (2005) 3786-3792; D. A. Peterson, Umbilical cord blood cells and brain stroke injur y : bringing in fresh blood to address an old problem, J Clin Invest. 114 (2004) 312-314; V. Silani, L. Cova, M. Corbo, A. Ciammola, E. Polli, Stem-cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis, Lancet 364 (2004) 200-202]. La sangre del cordón proporciona una fuente abundante para la generación de células madre, incluyendo células madre mesenquimales [K. Bieback, S. Kern, H. Kluter, H. Eichler, Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood, Stem Cells 22 (2004) 625-634; E. J. Gang, S.H. Hong, J. A. Jeong, S. H. Hwang, S.

W. Kim, I. H. Yang, C. Ahn, H. Han, H. Kim, In vitro mesengenic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, Biochem Biophys Res Commun. 321 (2004) 102-108; G. Kogler, S: Sensken, J. A. Airey, T. Trapp, M. Muschen, N. Feldhahn, S. Liedtke, R. V. Sorg, J. Fischer, C. Rosenbaum, S. Greschat, A. Knipper, J. Bender, O. Degistirici, J. Gao, A. I: Caplan, E. J. Colletti, G. Almeida-Porada, H. W. Muller, E. Zanjani, P. Wernet, A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential, J Exp Med. 200 (2004) 123-135] and monocyte-derived stem cells [Y. Zhao, T. Mazzone, Human umbilical cord blood-derived fmacrophages retain pluripotentiality after thrombopoietin expansion, Exp Cell Res. 310 (2005) 311-318]. Se ha informado de células madre que expresan marcadores moleculares de ES en la sangre del cordón después de la eliminación de las células hematopoyéticas (incluyendo la supresión de todas las células positivas para el antígeno común leucocitario CD45) [C. P. McGuckin, N. Forraz, M. O. Baradez, S. Navran, J. Zhao, R. Urban, R. Tilton, L. Denner, Production of stem cells with embr y onic characteristics from human umbilical cord blood, Cell Prolif. 38 (2005) 245-55]. Sin embargo, la escasez de esta población de células descrita anteriormente [C. P. McGuckin, N. Forraz, M. O. Baradez, S. Navran, J. Zhao, R. Urban, R. Tilton, L. Denner, Production of stem cells with embr y onic characteristics from human umbilical cord blood, Cell Prolif. 38 (2005) 245-55] en la sangre del cordón restringe significativamente su aplicación práctica.

También se han descrito varias otras células madre de tipo embrionario derivadas de fuentes de adultos en lugar de fuentes embrionarias. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Número 7.045.148, las Solicitudes de Patente de

los Estados Unidos Números de serie 2005/0148034, 2005/0118715, 2004/0028660, 2003/0235909, 2002/0160510, 2003/0180269 y la Solicitud de Patente Internacional Número WO 03/068937 describen células madre embrionarias extraídas de la placenta o de la sangre del cordón umbilical. La Solicitud de Patente de Estados Unidos Número de Serie 2006/0078993 describe células madre de tipo embrionario derivadas de la membrana amniótica de cordón umbilical. Las células madre descritas en estas patentes o solicitudes de patentes son de origen mesenquimal que no expresan el marcador CD45 (CD45-) . En otro ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos Número de Serie 2006/0147426 describe células madre derivadas de la médula ósea humana.

La presente invención se refiere a un tipo de células madre aisladas de sangre del cordón umbilical humano, denominadas en la presente memoria células madre de sangre del cordón umbilical (CB-SC) . Estas células madre son de origen hematopoyético (y no mesenquimales) como se indica por la alta expresión del marcador CD45 (CD45+) . Estas células pueden aislarse y expandirse utilizando una tecnología sencilla. Las CB-SC comparten propiedades con las células ES y las células hematopoyéticas humanas, incluyendo la baja inmunogenicidad, la capacidad para proliferar y la capacidad de diferenciarse a múltiples tipos de células.

Estos y otros aspectos y atributos de la presente invención se comentarán con referencia a los siguientes dibujos y la memoria descriptiva adjunta.

Breve resumen de la invención La presente invención proporciona células madre de tipo embrionario aisladas, composiciones y métodos como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención describe células madre de tipo embrionario aisladas de sangre de cordón umbilical humano, denominadas en la presente memoria CB-SC, para su uso en terapia basada en células madre, que se caracterizan por: (a) mostrar características de células madre embrionarias que comprenden una susceptibilidad a la proliferación y la capacidad para diferenciarse a diversos tipos de células, (b) mostrar características de las células hematopoyéticas que comprenden la expresión de CD45; (c) fenotípicamente distintas de los linfocitos, macrófagos y monocitos por ser negativas para los marcadores CD3, CD20, CD11b/Mac-1 y CD14; (d) fenotípicamente distintas de las células madre hematopoyéticas por ser negativas para el marcador CD34, (e) mostrar baja inmunogenicidad mediante la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) asociada con una baja inmunogenicidad, y (f) mostrar regulación inmunitaria por medio de la inhibición... [Seguir leyendo]

1. Células madre de tipo embrionario aisladas de sangre de cordón umbilical humano caracterizadas por:

(a) mostrar características de células madre embrionarias que comprenden la capacidad de proliferación y la capacidad de diferenciarse a diversos tipos de células, (b) mostrar características de las células hematopoyéticas que comprenden la expresión de CD45; (c) fenotípicamente distintas de linfocitos, macrófagos y monocitos por ser negativas para los marcadores CD3, CD20, CD11b/Mac-1 y CD14; (d) fenotípicamente distintas de las células madre hematopoyéticas por ser negativas para el marcador CD34, (e) mostrar baja inmunogenicidad mediante la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) asociadas con baja inmunogenicidad, y (f) mostrar una regulación inmunitaria por inhibición de la proliferación de linfocitos estimulada por mitógenos, para su uso en la terapia basada en células madre.

2. Las células madre para su uso en la terapia basada en células madre de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células madre son positivas para Oct-4 y Nanog.

3. Las células madre para su uso en la terapia basada en células madre de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde las células madre son positivas para CD9.

4. Las células madre para su uso en la terapia basada en células madre de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde las células madre producen óxido nítrico (NO) .

5. Las células madre para su uso en la terapia basada en células madre de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde las células madre no estimulan la proliferación de linfocitos en una reacción linfocítica mixta alogénica.

6. Las células madre para su uso en la terapia basada en células madre de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la regulación inmunitaria está caracterizada por efectos inhibidores de las células madre sobre la proliferación de linfocitos T y la regulación de los subgrupos de células T.

7. Las células madre para su uso en la terapia basada en células madre de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, capaces de diferenciarse a al menos un tipo de célula seleccionado del grupo de células de tipo endotelial, células de tipo neuronal, células productoras de insulina, oligodendrocitos y megacariocitos.

8. Las células madre para su uso en la terapia basada en células madre de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, la diabetes, la lesión de la médula espinal, las enfermedades cardiovasculares por esclerosis múltiple (EM) , el accidente cerebrovascular, los defectos de nacimiento o la hiperglucemia.

9. Una composición para su uso en la terapia basada en células madre, que comprende las células madre de tipo embrionario aisladas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

10. Un método para aislar las células madre de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende (a) proporcionar una muestra de sangre del cordón umbilical humano, (b) eliminar los glóbulos rojos de la muestra para obtener células mononucleares; (c) cultivar las células mononucleares en un medio de cultivo en un recipiente de cultivo no tratado para el cultivo de tejidos; y (d) obtener una población de células que está adherida al recipiente de cultivo.

11. Un método para regular subgrupos de linfocitos en un cultivo de células T mixto, comprendiendo el método el cultivo simultáneo una población diversa de linfocitos con las células madre de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

12. El método de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente al menos uno de (a) aumentar el porcentaje de células CD4-CD8-, (b) aumentar el porcentaje de células CD8+, (c) disminuir el porcentaje de células CD4+ o (d) disminuir razón CD4/CD8.