Asociados de enlace del factor de crecimiento placentario, en particular anticuerpos dirigidos contra el factor de crecimiento placentario, su producción y empleo.

Péptido inmunológicamente activo, el cual posee la secuencia de información en una isoforma P/GF primaria,

consistente en una de las siguientes secuencias de aminoácidos:

IAN 1: SAGNGSSEVE VVPFQEVWGR SYCRALERLV

IAN 3: VETANVTMQL LKIRSGDRP SYVELTFSQH

o en una parte de los péptidos IAN 1 o IAN 3, donde la parte contiene por lo menos una de las secuencias deaminoácidos

WPFQEVWGRSY (IAN: 1-1-2) o RSGDRPSYVELT (IAN: 3-3-1).

Asociados de enlace del factor de crecimiento placentario, en particular anticuerpos dirigidos contra el factor de crecimiento placentario, su producción y empleo.

La invención se refiere a asociados de enlace del factor de crecimiento placentario (Placental Growth Factor o Placenta Growth Factor, P/GF) en particular anticuerpos dirigidos contra el factor de crecimiento placentario, su producción y empleo.

El P/GF está involucrado de manera crucial en procesos fisiológicos patológicos, en particular en la angiogénesis. Juega un papel importante en la progresión tumoral, por afecciones renales que son provocadas en particular por diabetes Mellitus, por psoriasis, enfermedades inflamatorias, en particular artritis reumatoide, por enfermedades cardiovasculares y otras [Iyer, S.; Leonidas, D. D.; Swaminathan, G. J.; Maglione, D.; Battisti, M.; Tucci, M.; Persico,

M. G.; Achar y a, K. R. J Biol Chem 2001, 276, (15) , 12153-61. / Iyer, S.; Achar y a, K. R. Trends Cardiovasc Med 2002, 12, (3) , 128-34. / Heeschen, C.; Dimmeler, S.; Fichtlscherer, S.; Hamm, C. W.; Berger, J.; Simons, M. L.; Zeiher, A.

M. JAMA 2004, 291, (4) , 435-41. / Yang, W.; Ahn, H.; Hinrichs, M.; Torr y , R. J.; Torr y , D. S. J Reprod Inmunol 2003, 60, (1) , 53-60.].

El P/GF se expresa de manera predominante en la placenta y pertenece a la familia de proteínas de "nudo de cisteina". P/GF está presente en diferentes formas. Son diferentes formas de P/GF (I) isoformas primarias y (II) isoformas secundarias. (III) además pueden diferenciarse entre P/GF libre (fP/GF) y P/GF enlazado (gP/GF) .

(I) Isoformas P/GF primarias Las isoformas P/GF primarias son determinadas por la secuencia primaria, es decir la sucesión de los aminoácidos en la proteína. El trenzado alternativo así como modificaciones post-translacionales, como glicosilaciones, fosforilaciones, degradación (productos de degradación, fragmentos, etc.) , acetilaciones, etc., conducen a diferentes isoformas P/GF primarias. Hasta ahora se habían descrito cuatro diferentes isoformas primarias del P/GF humano, P/GF- 1 (P/GF- 131) , P/GF- 2 (P/GF152) , P/GF- 3 (P/GF- 203) y P/GF- 4.

La secuencia del precursor P/GF-1 (número de secuencia (SN) 1V) se lee como sigue:

SN 1 V:

MPVMRLFPCF LQLLAGLALP AVPPQQWALS AGNGSSEVEV VPFQEVWGRS YCRALERLVD

VVSEYPSEVE HMFSPSCVSL LRCTGCCGDE NLHCVPVETA NVTMQLLKIR SGDRPSYVEL

121 TFSQHVRCEC RPLREKMKPE RCGDAVPRR

El P/GF- 1 segregado no posee por regla general la secuencia líder del precursor P/GF- 1 (precursor P/GF) y comienza con ello de manera terminal en N con alanina (A) (indicada en la secuencia del precursor P/GF- 1 como A, ver arriba) . Por regla general, esto aplica también para las otras isoformas primarias de P/GF.

La frecuencia de la isoforma primaria de P/GF-1 se lee con ello como sigue:

SN 1:

ALPAVPPQQW ALSAGNGSSE VEVVPFQEVW GRSYCRALER LVDVVSEYPS EVEHMFSPSC

VSLLRCTGCC GDENLHCVPV ETANVTMQLL KIRSGDRPSY VELTFSQHVR CECRPLREKM

121 KPERCGDAVP RR

Esta secuencia primaria permite reconocer posiciones posibles para modificaciones post-translacionales y con ello también la ocurrencia de isoformas primarias modificadas de modo post-translacional. Por ejemplo, en general está presente in vivo la isoforma P/GF primaria modificada por vía translacional del P/GF-1 glicosilado en la posición 84 (asparigina, N) .

Como primer aminoácido terminal en N de la isoforma primaria de P/GF- 1 se indica frecuentemente en lugar de alanina la metionina (M) . Esto se refiere en general a P/GF- 1 recombinante (rP/GF- 1) expresado por ejemplo en Escherichia coli (E. coli) , en particular en el rP/GF- 1 humano (rhP/GF- 1) . Aquí se emplea como codón de inicio

AUG, el cual codifica para metionina. Tal P/GF expresado en E. coli no posee modificaciones post-translacionales, en particular tampoco glicosilaciones. La secuencia de la isoforma P/GF-1 primaria humana recombinante es indicada en general de la siguiente forma: SN 1RH: 1 MLPAVPPQQW ALSAGNGSSE VEVVPFQEVW GRSYCRALER LVDVVSEYPS EVEHMFSPSC 61 VSLLRCTGCC GDENLHCVPV ETANVTMQLL KIRSGDRPSY VELTFSQHVR CECRPLREKM

121 KPERCGDAVP RR Mediante el trenzado alternante, en la isoforma P/GF-2 en lugar de la arginina (R) 124 se encuentra la secuencia RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL. De allí que la secuencia de la isoforma P/GF-2 primaria se lee:

SN 2: 1 ALPAVPPQQW ALSAGNGSSE VEVVPFQEVW GRSYCRALER LVDVVSEYPS EVEHMFSPSC 61 VSLLRCTGCC GDENLHCVPV ETANVTMQLL KIRSGDRPSY VELTFSQHVR CECRPLREKM 121 KPERRRPKGR GKRRREKQRP TDCHLCGDAV PRR

Una inserción de 72 aminoácidos incluida mediante trenzado alternante (HSPGRQSPDMPGDFRADAPS FLPPRRSLPMLFRMEWGCALTGSQSAVWPSSPVPEEI PRMHPGRNGKKQQRK) conduce a la secuencia de isoforma primaria de P/GF-3:

SN 3: 1 ALPAVPPQQW ALSAGNGSSE VEVVPFQEVW GRSYCRALER LVDVVSEYPS EVEHMFSPSC 61 VSLLRCTGCC GDENLHCVPV ETANVTMQLL KIRSGDRPSY VELTFSQHVR CECRHSPGRQ 121 SPDMPGDFRA DAPSFLPPRR SLPMLFRMEW GCALTGSQSA VWPSSPVPEE IPRMHPGRNG 181 KKQQRKPLRE KMKPERCGDA VPRR

La isoforma primaria P/GF-4 incluye tanto secuencias de la isoforma P/GF-2 (cursiva) como también de la isoforma P/GF-3 (subrayada) : SN 4: 1 ALPAVPPQQW ALSAGNGSSE VEVVPFQEVW GRSYCRALER LVDVVSEYPS EVEHMFSPSC 61 VSLLRCTGCC GDENLHCVPV ETANVTMQLL KIRSGDRPSY VELTFSQHVR CECRHSPGRQ 121 SPDMPGDFRA DAPSFLPPRR SLPMLFRMEW GCALTGSQSA VWPSSPVPEE IPRMHPGRNG 181 KKQQRKPLRE KMKPERRRPK GRGKRRREKQ RPTDCHLCGD AVPRR

(II) Isoformas secundarias P/GF

Las isoformas P/GF secundarias surgen de la combinación de isoformas P/GF primarias u otras moléculas, en particular moléculas que son homólogas a P/GF. Las isoformas P/GF primarias o bien otras moléculas representan subunidades de las isoformas P/GF secundarias. En general las isoformas P/GF secundarias consisten en dos subunidades. Con ello por regla general P/GF está presente como dímero, es decir como homodímero o heterodímero. Los homodímeros consisten en dos isoformas P/GF primarias iguales (subunidades) como P/GF-1 x

P/GF-1, P/GF-2 x P/GF-2, P/GF-3 x P/GF-3 y P/GF-4 x P/GF-4. Los heterodímeros consisten en dos isoformas primarias P/GF diferentes o una isoforma P/GF primaria y otra molécula, en particular homólogos de P/GF como el

factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y sus isoformas primarias. Son ejemplos posibles de heterodímeros P/GF-1 x P/GF-2, P/GF-3 x P/GF-4, P/GF-1 x VEGF, etc.

(III) P/GF (fP/GF) libre y P/GF (gP/GF) enlazado Puesto que P/GF forma complejos con asociados de enlace, aparte de las isoformas son de considerar también las formas de P/GF que forman complejos o bien que están enlazadas. En principio son de diferenciar las isoformas P/GF primarias libres, sin embargo en particular las isoformas P/GF secundarias libres (P/GF, fP/GF libres) de las formas que forman complejos o bien que están enlazadas (P/GF, gP/GF enlazados) . El gP/GF es por ejemplo homodímero P/GF- 1, que está presente en forma de complejo. Para esto puede ser un complejo simple, es decir un homodímero P/GF- 1 está unido a un receptor, por ejemplo al receptor 1 de tirosinquinasa (mFlt- 1) unido a la membrana similar a fms. Otros ejemplos son complejos con la Flt- 1 soluble (sFlt- 1) , con neurofilinas (NP; en particular NP- 1 y NP- 2) , con el receptor que contiene el dominio de quinasa/receptor de quinasa de hígado fetal (KDR/Flk- 1, VEGFR- 2) , con heparinsulfatoproteoglicanos (HSPG) así como sus isoformas, homólogos, fragmentos y productos de degradación. Así mismo son imaginables complejos compuestos multifacéticos de varias y dado el caso en diferentes isoformas P/GF y varios y dado el caso diferentes asociados de enlace, en particular receptores.

La función de P/GF es promovida, modulada o bien inhibida mediante el enlace al receptor 1 de tirosinquinasa (mFlt1) unido a la membrana o bien soluble similar a fms (receptor de tirosinquinasa similar a 1 fms (Flt- 1) o receptor 1 de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF (VEGFR- 1) ) así como el “receptor que contiene el dominio de quinasa/receptor de quinasa de hígado fetal ( (KDR/Flk- 1 o bien VEGFR- 2) . Aparte de otras posibles funciones de P/GF es relevante en particular el enlace de P/GF a Flt-1 (mFlt- 1) unido a la membrana. Esto conduce a la transfosforilación de mFlt-1 y activa con ello las cascadas de transducción de señal [Iyer, S.; Achar y a, K. R. Trends Cardiovasc Med 2002, 12, (3) , 128- 34.].

En contraste con esto se da por sentado que la unión de P/GF a sFlt-1 sirve para reducir la actividad fisiológica de P/GF [Iyer, S.; Achar y a, K. R. Trends Cardiovasc Med 2002, 12, (3) , 128-34.]. Además, se da por sentado que la isoforma P/GF juega un papel. P/GF -2, el cual tal vez está asociado con la membrana, posee una inserción catiónica de 21 aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Péptido inmunológicamente activo, el cual posee la secuencia de información en una isoforma P/GF primaria, consistente en una de las siguientes secuencias de aminoácidos:

IAN 1: SAGNGSSEVE VVPFQEVWGR SYCRALERLV IAN 3: VETANVTMQL LKIRSGDRP SYVELTFSQH

o en una parte de los péptidos IAN 1 o IAN 3, donde la parte contiene por lo menos una de las secuencias de aminoácidos WPFQEVWGRSY (IAN: 1-1-2) o RSGDRPSYVELT (IAN: 3-3-1) .

2. Anticuerpo monoclonal 05-81-05, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005-81-05, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2764.

3. Anticuerpo monoclonal 05-81-010, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005-81-010, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2765.

4. Anticuerpo monoclonal 05-64/026, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005-64/026, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2766.

5. Anticuerpo monoclonal 05-54/04, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005-54/04, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2769.

6. Anticuerpo monoclonal 05-164/054, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005-164/054, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2770.

7. Anticuerpo monoclonal 05-164/042, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005-164/042, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2771.

8. Anticuerpo monoclonal 05-164/038, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005-164/038, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2772.

9. Anticuerpo monoclonal 05-164/012, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005164/012, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2773.

10. Anticuerpo monoclonal 05-121/06, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005-121/06, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2774.

11. Anticuerpo monoclonal 05-120/03, el cual es producido de la línea de células con la denominación 2005-120/03, el cual había sido depositado en el DSMZ bajo el número de ingreso DSM ACC2775.

12. Anticuerpo específico que compite para unirse al P/GF libre con uno o varios de los anticuerpos monoclonales según una o varias de las reivindicaciones 2, 3 y 6 a 11.

13. Anticuerpo específico que está unido a un epítope, presente en la siguiente secuencia de aminoácidos RSGDRPSYVELT.

14. Anticuerpo específico que está unido a un epítope, presente en la siguiente secuencia de aminoácidos: VVPFQEVWGRSY.

15. Péptidos según la reivindicación 1 para empleo como antígeno de inmunización para la producción de anticuerpos específicos de fP/GF.

16. Inmunoensayo para la detección de P/GF en una muestra, caracterizado porque un anticuerpo específico según una o varias de las reivindicaciones 2 a 14 es puesto en contacto con una muestra y se determina de manera cualitativa o cuantitativa la formación de un inmunocomplejo con participación del P/GF.

17. Equipo de prueba para la ejecución de un inmunoensayo según la reivindicación 16 que contiene un anticuerpo específico según una o varias de las reivindicaciones 2 a 14.