ARNip dirigido a tp53.

Una molécula de ARNip que comprende una región bicatenaria que consiste de una cadena codificante y unacadena no codificante,

en donde dicha cadena codificante comprende la secuencia GAGAAUAUUUCACCCUUCA(sec. con núm. de ident. 512,246).

ARNip dirigido a tp53

Campo de la invención La presente invención se refiere a la interferencia por ARN ("iARN") .

Antecedentes de la invención Hace relativamente poco, los investigadores observaron que el ARN bicatenario ("ARNbc") se podría usar para inhibir la expresión de proteínas. Esta capacidad de silenciar un gen tiene un amplio potencial para el tratamiento de enfermedades humanas, y muchos investigadores y entidades comerciales están invirtiendo en la actualidad importantes recursos en el desarrollo de terapias basadas en esta tecnología.

El silenciamiento génico inducido por ARN bicatenario puede aparecer en al menos tres niveles diferentes: (i) inactivación de la transcripción, que se refiere a la metilación de las histonas o del ADN guiada por ARN, (ii) degradación del ARNm inducida por ARNip, y (iii) atenuación transcripcional inducida por ARNm.

Se considera generalmente que el principal mecanismo de silenciamiento inducido por ARN (interferencia por ARN, o iARN) en células de mamífero es la degradación del ARNm. Los intentos iniciales de usar el iARN en células de mamífero se centraron en el uso de largas cadenas de ARNbc. Sin embargo, estos intentos de inducir iARN encontraron con un éxito limitado, debido en parte a la inducción de la respuesta de interferón, que resulta en una inhibición general de la síntesis de proteínas, en lugar de una inhibición específica de la diana. Así, un ARNbc largo no es una opción viable para el iARN en sistemas de mamíferos.

Más recientemente se demostró que cuando se introducen las dobles cadenas de ARN cortas (18-30 pb) en células de mamífero en cultivo, puede realizarse la inhibición específica de la secuencia del ARNm diana sin inducir una respuesta de interferón. Algunos de estos ARNbc cortos, denominados ARN inhibidores pequeños ("ARNip") , pueden actuar catalíticamente a concentraciones submolares para escindir más del 95% del ARNm diana en la célula. Una descripción de los mecanismos para la actividad de ARNip, así como también algunas de sus aplicaciones se describen en Provost y otros, Ribonuclease Activity and RNA Binding of Recombinant Human Dicer, EMBO J., 2002 nov. 1; 21 (21) : 5864-5874; Tabara y otros, The dsRNA Binding Protein RDE-4 Interacts with RDE-1, DCR-1 and a DexH-box Helicase to Direct RNAi in C. elegans, Cell 2002, junio 28;109 (7) :861-71; Ketting y otros, Dicer Functions in RNA Interference and in Synthesis of Small RNA Involved in Developmental Timing in C. elegans, Martínez y otros, Single-Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi, Cell 2002, sept. 6; 110 (5) :563; Hutvagner & Zamore, A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex, Science 2002, 297:2056.

Desde un punto de vista mecanicista, la introducción de ARN largos bicatenarios en células de plantas e invertebrados se fragmenta en ARNip mediante una endonucleasa tipo III conocida como Dicer. Sharp, RNA interference-2001, Genes Dev. 2001, 15:485. Dicer, una enzima similar a la ribonucleasa III, procesa el ARNbc en ARN de interferencia cortos de 19-23 pares de bases con dos bases colgantes características en 3'. Bernstein, Caudy, Hammond, & Hannon, Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 2001, 409:363. Los ARNip se incorporan después en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) donde una o más helicasas desenrollan la doble cadena de ARNip, lo que permite que la cadena no codificante complementaria guíe al reconocimiento de la diana. Nykanen, Haley, & Zamore, ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway, Cell 2001, 107:309 Tras la unión al ARNm diana adecuado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden la diana para inducir silenciamiento. Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs, Genes Dev 2001, 15:188, Figura 1.

El efecto de interferencia puede ser de larga duración y puede ser detectable después de muchas divisiones celulares. Por otra parte, el iARN exhibe especificidad de secuencia.Kisielow, M. y otros (2002) Isoform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcA using small interfering RNA, J. of Biochemistr y 363:1-5. Así, la maquinaria de iARN puede reducir específicamente un tipo de transcrito, mientras que no afecta a ARNm estrechamente relacionados. Estas propiedades hacen al ARNip una herramienta potencialmente valiosa para la inhibición de la expresión génica y el estudio de la función de genes y la validación de dianas de fármacos. Por otra parte, los ARNip son potencialmente útiles como agentes terapéuticos contra: (1) enfermedades causadas por la sobreexpresión o expresión errónea de genes, y (2) enfermedades provocadas por la expresión de genes que contienen mutaciones.

El silenciamiento exitoso de genes dependiente de ARNip depende de un número de factores. Uno de los temas más polémicos en el iARN es la cuestión de la necesidad del diseño del ARNip, es decir, considerar la secuencia del ARNip que se usa. Los primeros trabajos en C. elegans y plantas evitaron el tema del diseño mediante la introducción de ARNbc largos (ver, por ejemplo, Fire, A. y otros (1998) Nature 391:806-811) . En este organismo primitivo, las moléculas de ARNbc largos se escinden en ARNip mediante Dicer, generando así una población variada de dobles cadenas que pueden cubrir potencialmente todo el transcrito. Si bien una fracción de estas moléculas no son funcionales (es decir inducen poco o ningún silenciamiento) una o más tienen el potencial de ser altamente funcionales, silenciando de esta manera el gen de interés y aliviando la necesidad del diseño de ARNip. Desafortunadamente, debido a la respuesta de interferón, este mismo enfoque no está disponible para los sistemas de mamíferos. Si bien este efecto puede evitarse al no pasar por la etapa de escisión por Dicer e introducir directamente el ARNip, esta táctica lleva consigo el riesgo de que la secuencia elegida de ARNip puede ser no funcional o semifuncional.

Un número de investigaciones han expresado la opinión de que el diseño de ARNip no es un elemento crucial del iARN. Por otro lado, otros en el campo han comenzado a explorar la posibilidad de que el iARN pueda hacerse más eficiente mediante la atención al diseño, del ARNip. Desafortunadamente, ninguno de los métodos reportados ha proporcionado un esquema satisfactorio para la selección de forma fiable de ARNip con niveles aceptables de funcionalidad. En consecuencia, hay una necesidad de desarrollar criterios racionales para seleccionar ARNip con un nivel aceptable de funcionalidad, y para identificar ARNip que tienen este nivel de funcionalidad mejorada, así como también para identificar ARNip que son hiperfuncionales.

WO 03/056012 se refiere a un polinucleótido que comprende un promotor de ARN polimerasa III, una región que codifica un ARNip, y un elemento de terminación transcripcional que comprende cinco residuos de timina consecutivos. WO 03/056012 describe además vectores, células y animales transgénicos no humanos que comprenden los polinucleótidos así como también su uso en medicamentos para diversas condiciones.

WO 00/24885 describe oligonucleótidos no codificantes útiles para tratar un estado de enfermedad caracterizado por la inducción de p53.

Resumen de la invención La presente invención se orienta a aumentar la eficiencia de la iARN, particularmente en los sistemas de mamíferos. En consecuencia, la presente invención proporciona kits, ARNip y métodos para aumentar la eficacia de los ARNip.

Particularmente, la presente invención proporciona una molécula de ARNip que comprende una región bicatenaria que consta de una cadena codificante y una cadena no codificante, en donde dicha cadena codificante comprende la secuencia GAGAAUAUUUCACCCUUCA (sec. con núm. de ident.: 512246) .

Preferentemente la molécula de ARNip de la invención consiste de: (a) dicha región bicatenaria, y (b) sin bases colgantes o bases colgantes que contienen de uno a seis nucleótidos en el extremo 5' o 3' de la cadena codificante y/o la cadena no codificante. Preferentemente dicha región bicatenaria de la molécula de ARNip de la invención es de 19 - 30 pares de bases de longitud, por ejemplo 19 - 30 pares de bases de longitud, por ejemplo 19 pares de base de longitud Preferentemente la molécula de ARNip de la invención tiene: (a) bases colgantes, o (b) no tiene bases colgantes. Preferentemente la molécula de ARNip de la invención es efectiva en el silenciamiento de tp53.

La presente invención proporciona además una molécula de ARNip de la invención para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal, por ejemplo en donde dicho método es un... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ARNip que comprende una región bicatenaria que consiste de una cadena codificante y una cadena no codificante, en donde dicha cadena codificante comprende la secuencia GAGAAUAUUUCACCCUUCA 5 (sec. con núm. de ident. 512, 246) .

2. La molécula de ARNip de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de ARNip consiste de:

(a) dicha región bicatenaria; y

(b) las bases no colgantes o las bases colgantes que contienen uno a seis nucleótidos en el extremo 5' o 3' de la cadena codificante y/o de la cadena no codificante.

3. La molécula de ARNip de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha región bicatenaria es de 19-30 pares de base de longitud.

4. La molécula de ARNip de la reivindicación 3, en donde dicha región bicatenaria es de 19-25 pares de base de longitud.

5. La molécula de ARNip de la reivindicación 4, en donde dicha región bicatenaria es de 19 pares de bases de 20 longitud.

6. La molécula de ARNip de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha molécula de ARNip tiene bases colgantes.

7. La molécula de ARNip de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha molécula de ARNip no tiene bases colgantes.

8. Una molécula de ARNip como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para usar en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal.

9. Un método para silenciar tp53 que comprende usar la molécula de ARNip como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho método no es un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por cirugía o terapia o un método diagnóstico practicado sobre el cuerpo humano o animal.

10. Una mezcla de al menos dos moléculas de ARNip, en donde la primera molécula de ARNip es una molécula de ARNip como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y cada molécula de ARNip adicional es efectiva en el silenciamiento de tp53.