Anticuerpo monoclonal antagonista anti CD40 humano.

Un anticuerpo anti-CD40 que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadenapesada,

comprendiendo dicha región variable de cadena pesada una secuencia de aminoácidosen la que: **Fórmula**

X1 es I y X2 es V;

X1 es L y X2 es I;

X1 es V y X2 es V;

X1 es L y X2 es L; o

X1 es L y X2 es V; y

X3 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H;

X4 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; y

X5 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H;

y comprendiendo dicho dominio variable decadena ligera una secuencia de aminoácidos.

Anticuerpo monoclonal antagonista anti CD40 humano La invención se refiere a anticuerpos humanos, humanizados y monoclonales con inmunogenicidad reducida, usos y procedimientos de producción de los mismos. La invención se refiere en particular a anticuerpos monoclonales antagonistas anti CD40 humano.

La molécula CD40 es una glicoproteína de membrana de tipo I de 50 kDa y se expresa en linfocitos B, monocitos/macrófagos, células dendríticas (DC) y células endoteliales activadas1-6. En ciertas condiciones, también se puede encontrar CD40 en fibroblastos, células epiteliales y queratinocitos7. El ligando de CD40 (CD40L, CD154) , una glicoproteína de membrana integral de tipo II de 32 kDa, se expresa de forma transitoria en linfocitos T CD4+ activados y una población pequeña de linfocitos T CD8+ activados8, 9. Además, se ha descubierto CD40L en varios otros tipos celulares después de activación, incluyendo mastocitos, basófilos, linfocitos B, eosinófilos, DC y plaquetas.10, 11

Estudios en modelos murinos han demostrado claramente la implicación de la interacción CD40L-CD40 en la patofisiología de diversas enfermedades autoinmunes (para una revisión, véase la referencia12) . Las pruebas de ratones transgénicos CD40L, que adquieren enfermedad inflamatoria del intestino letal, proporcionaron las primeras pruebas de que las interacciones CD40-CD40L también podrían desempeñar un papel en la patogénesis de enfermedades inflamatorias del intestino13. Un anticuerpo monoclonal anti CD40L de ratón (mAb) evita eficazmente la inflamación de la mucosa y la producción de interferón-y por linfocitos T CD4+ de lámina propia en colitis inducida por TNBS14. En un modelo de enfermedad inflamatoria en el intestino de ratón con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) se mostró que el tratamiento con anti CD40L desde el día de la reconstitución de linfocitos T evitó completamente la aparición clínica e histológica de colitis experimental15. Además, la administración de anti CD40L desde la semana 5 después de la reconstitución de linfocitos T aún pudo prevenir la progresión de la enfermedad y los animales tratados mostraron mejora en los síntomas de la enfermedad e histología en comparación con animales de control15. Además, la reconstitución de ratones SCID con linfocitos T de ratones con supresión de CD40L, demostró adicionalmente el papel esencial de los linfocitos T que expresan CD40L en desarrollo de enfermedades y producción de interleucina-12.16

La interacción CD40-CD40L puede antagonizarse por anticuerpos monoclonales (mAb) contra CD40L o CD40. La expresión de CD40L en plaquetas activadas ha dado como resultado acontecimientos trombo-embólicos durante el tratamiento de seres humanos con mAb IgG1 anti CD40L humano a niveles de dosis mayores y terminación del desarrollo de estos Mab17, 19. El antagonismo de CD40 parece por lo tanto un enfoque más atractivo. La actividad antagonista no estimuladora de mAb 5D12 (anti CD40 humano) se demostró en diversos estudios in vitro usando diferentes tipos celulares que portan CD4020, 22 y la actividad antagonista de 5D12 quimérico (ch5D12) se validó in vivo usando diversos modelos de enfermedad de primates no humanos23, 27. ch5D12 es un anticuerpo IgG4 humano modificado por ingeniería genética molecularmente que contiene los dominios variables murinos de las cadenas pesada y ligera de 5D12 y se construyó para reducir el potencial de inmunogenicidad y para potenciar la semivida in vivo del mAb 5D12 murino usado en seres humanos.

Los pacientes con enfermedad de Crohn padecen un trastorno inflamatorio debilitante del tracto gastrointestinal cuya etiología y patogénesis precisas siguen siendo esquivas28, 29. La enfermedad se caracteriza por un flujo de entrada en mucosa enferma de linfocitos T activados, linfocitos B y macrófagos, 30, 31 producción local de mediadores solubles de inflamación y daño de tejidos implicados28, 29. Se ha mostrado que los linfocitos T CD4+ de la mucosa y macrófagos y citocinas tales como factor de necrosis tumoral (TNF) -α e IL-12 desempeñan un papel central en el inicio de un bucle inflamatorio en enfermedad de Crohn32, 38.Los linfocitos T de mucosa inflamada muestran una capacidad proliferativa mayor28, 29 y secretan cantidades aumentadas de IFN-γ e IL-2. Se han descubierto niveles aumentados de transcritos de ARNm de citocinas asociadas con linfocitos T en biopsias de la mucosa de pacientes con enfermedad de Crohn33. Se ha sugerido un papel dominante de CD40L en los linfocitos T CD4+ activados en los estudios de los inventores sobre la expresión de CD40/CD40L en lesiones de enfermedad de Crohn39. CD40L puede mediar en una activación fuerte de células portadoras de CD40, predominantemente linfocitos B y macrófagos, dando como resultado de este modo el aumento de la producción de TNF-α e IL-12 en lesiones. Usando inmunohistoquímica, se descubrió tinción aumentada con 5D12 en todas las muestras de áreas enfermas de pacientes con enfermedad de Crohn en comparación con áreas no enfermas. La doble tinción para CD40 y CD20 (linfocitos B) o CD68 (macrófagos) indicó que en las secciones de pacientes con enfermedad de Crohn, las células CD40+ eran principalmente linfocitos B en los folículos linfoides y macrófagos en la lámina propia. Los linfocitos T de lámina propia de mucosa inflamada de pacientes con enfermedad de Crohn indujeron que los monocitos produjeran cantidades significativas de IL-12 y TNF-α después de 48 horas de co-cultivo. La adición de 5D12 dio como resultado reducción de la producción de IL-12 y TNF-α; los niveles de producción se redujeron a los niveles observados usando linfocitos T de lámina propia de control tanto en ausencia como en presencia de IFN-γ.39

Es un objetivo de la invención proporcionar moléculas alternativas que compartan al menos el tipo de seguridad y/o eficacia de 5D12 in vivo, no necesariamente la cantidad de dicha seguridad y/o eficacia. El anticuerpo 5D12, o al menos los dominios variables del mismo, tienen un fondo murino. La presente invención proporciona variantes de los dominios variables de cadena pesada y ligera de 5D12. Para este fin la invención proporciona un anticuerpo anti CD40 que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, comprendiendo dicha región variable de cadena pesada una secuencia de aminoácidos en la que:

X1 es I y X2 es V; X1 es L y X2 es I; X1 es V y X2 es V; X1 es L y X2 es L; o X1 es L y X2 es V; y

X3 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; X4 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; y X5 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; y

dicho dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos en la que:

X6 es N, Q, S, T, Y, W o C; X7 es D, E, N, Q, S, T, Y, W o C; X8 es N, Q, S, T, Y, G, A, V, L, I, P, F, M, W o C; X9 es G, A, V, L, I, P, F, M; X10 es G, A, V, L, I, P, F, M; y

X11 es N, Q, S, T, Y, G, A, V, L, I, P, F, M, W o C.

También se describe un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula (I)

en la que:

X1 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; X2 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; X3 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; X4 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; y

X5 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H.

Dicho polipéptido comprende identidad de secuencia extensiva con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 5D12, sin embargo, el polipéptido es menos inmunogénico en un individuo humano, administrado como tal o en el contexto de un anticuerpo que comprende dicho polipéptido. En las posiciones indicadas X1-X5 pueden estar presentes varios aminoácidos como se indica. Una molécula de unión que comprende un polipéptido de la invención tiene buenas propiedades de unión a CD40. Se ha observado que la producción del anticuerpo en una célula varía en cierto grado con el tipo de aminoácido en las posiciones indicadas. Esto se detallará en otro lugar posteriormente en el presente documento.

También se describe un polipéptido de fórmula (I) que comprende una secuencia de aminoácidos

En el polipéptido anteriormente mencionado abarca esencialmente el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo 5D12 murino. La secuencia de aminoácidos está alterada en varias posiciones con respecto a la secuencia murina. El polipéptido alterado acopla buenas propiedades de unión, tolerándose bien al mismo tiempo por seres humanos a los que se ha proporcionado el polipéptido. En las posiciones indicadas pueden insertarse... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-CD40 que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, comprendiendo dicha región variable de cadena pesada una secuencia de aminoácidos en la que:

X1 es I y X2 es V; X1 es L y X2 es I; X1 es V y X2 es V; X1 es L y X2 es L; o

X1 es L y X2 es V; y X3 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; X4 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; y X5 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T, Y, D, E, K, R o H; y comprendiendo dicho dominio variable de cadena ligera una secuencia de aminoácidos en la que:

X6 es N, Q, S, T, Y, W o C; X7 es D, E, N, Q, S, T, Y, W o C; X8 es N, Q, S, T, Y, G, A, V, L, I, P, F, M, W o C; X9 es G, A, V, L, I, P, F, M; X10 es G, A, V, L, I, P, F, M; y X11 es N, Q, S, T, Y, G, A, V, L, I, P, F, M, W o C.

2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

X3 es G, A, V, L, I, P, F, M; X4 es G, A, V, L, I, P, F, M; y X5 es G, A, V, L, I, P, F, M, W, C, N, Q, S, T o Y.

3. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que:

X3 es G, A, V, L, I, P, F, M; X4 es G, A, V, L, I o M; y X5 es P, F, W, N, Q, S, T o Y.

4. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que:

X1 es L; X2 es I; X3 es P; X4 es M; y X5 es S.

5. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

X3 es P; X4 es M; y X5 es F o X5 es S, preferentemente S.

6. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que: X1 es L; X2 es V; X3 es L; X4 es L y X5 es F.

7. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende una región constante de un anticuerpo humano, preferentemente una región constante de IgG.

8. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha región constante es una región que es deficiente en la activación del complemento, preferentemente región constante de IgG4 humana o una región constante de IgG1 humana mutada.

9. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Una célula que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.

11. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 siendo el anticuerpo un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano antagonista.

12. Un anticuerpo monoclonal antagonista anti-CD40 humano de acuerdo con la reivindicación 11 estando el anticuerpo desinmunizado.

13. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 en el que X6 es T o S, X7 es D o Q, X8 es Q o P, X9 es V o A, X10 es V o L y X11 es F o Y.

14. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en el que: X6 es T, X7 es Q, X8 es P, X9 es A, X10 es V y X11 es Y.

15. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14.

16. Una célula que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14 o un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 15.

17. Una célula de acuerdo con la reivindicación 16, que produce dicho anticuerpo.

18. Una célula de acuerdo con la reivindicación 10, 16 o 17, que es una célula de hibridoma, una célula de ovario de hámster chino, una célula NSO o una célula PER-C6TM.

19. Un cultivo celular que comprende una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16-18.

20. Un procedimiento para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10, 16-18 y recoger dicho anticuerpo de dicho cultivo.

21. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, 11-13, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o 15 y/o una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 16-18.

22. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, 11-14, un ácido nucleico de acuerdo

con la reivindicación 9 o 15 y/o una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 16-18 para su uso como un medicamento.

23. Uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, 11-14, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 o 15 y/o una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 16-18 para la fabricación de un medicamento para aliviar un síntoma de un trastorno autoinmune y/o un trastorno inflamatorio y/o para reducir el rechazo de trasplantes y/o para el tratamiento de cánceres positivos para CD40.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23 en el que dicho trastorno autoinmune y/o uno inflamatorio se selecciona del grupo de artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, psoriasis, penfigoide ampollar y dermatitis atópica.

25. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho trastorno autoinmune y/o uno inflamatorio comprende 15 enfermedad inflamatoria del intestino.

26. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicha enfermedad inflamatoria del intestino comprende colitis ulcerosa (UC) o enfermedad de Crohn (CD) .

27. Un procedimiento para seleccionar un anticuerpo antagonista anti-CD40 humano que comprende generar un primera línea celular que produce un anticuerpo antagonista anti-CD40 original y determinar la cantidad de

anticuerpo original que produce dicha primera línea celular, comprendiendo dicho anticuerpo original la secuencia de aminoácidos de cadena ligera y la secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada en la que X1 y X2 se seleccionan por pares del grupo que consiste en X1 = I y X2 = V; X1 = L y X2 = I; X1 = V y X2 = V; X1 = L y X2 = L; o X1 = L y X2 = V, comprendiendo dicho procedimiento además generar al menos una línea celular adicional que produzca una variante de dicho anticuerpo original en la que dicho

anticuerpo variante es un anticuerpo original modificado que comprende una inserción, deleción, inversión y/o sustitución de entre aproximadamente 1 y 5 aminoácidos en comparación con dicho anticuerpo original, en la que dicha modificación no consiste en una modificación de los aminoácidos en la posición o las posiciones identificadas por X1 y X2, y determinar la cantidad de anticuerpo variante que produce dicha al menos una línea celular adicional, comprendiendo además dicho procedimiento seleccionar un anticuerpo variante que se produjo en una cantidad que era al menos el 50 % de la cantidad del anticuerpo original.

28. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, en el que dicha inserción, deleción, inversión y/o sustitución de entre aproximadamente 1 y 5 aminoácidos es en dicha secuencia de aminoácidos de cadena pesada o dicha secuencia de aminoácidos de cadena ligera en comparación con la secuencia de aminoácidos de cadena correspondiente en dicho anticuerpo original.

29. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicha inserción, deleción, inversión y/o sustitución de entre aproximadamente 1 y 5 aminoácidos es en dicha secuencia de aminoácidos de cadena pesada en comparación con dicha secuencia de cadena pesada de dicho anticuerpo original.

30. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 29, que comprende además generar una línea celular productora de anticuerpos que produzca dicho anticuerpo seleccionado.

31. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 30, que comprende además recoger dicho anticuerpo seleccionado.

Figura 11: Perfiles de crecimiento y acumulación de anticuerpos para las líneas celulares L107 (DC1; panel superior) , L25 (DC2; panel medio) y M95 (DC3; panel inferior) en cultivo en matraz de agitación semicontinuo CDACF

e.t. de la media de 4 experimentos separados.

Figura 17: Inhibición de liberación de IL-8 por células THP-1 después de cocultivo con células Jurkat

Figura 18

Secuencia proteica de cadena pesada y ligera de PG102

Las secuencias señal están subrayadas, las regiones variables en negrita. Cadena pesada:

Cadena ligera:

Secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de PG102

Las secuencias señal se indican subrayadas, las regiones variables en negrita y los codones de parada en minúscula.

Cadena pesada:

Cadena ligera: