Procedimiento de conjugación que implica las etapas siguientes:

A. activación de un antígeno de polisacárido exento de endotoxina contra un polisacárido polifuncional mediante un espaciador de diamino-alquilo introducido mediante: A1. desacoplamiento del O-de-hidrógeno obtenido mediante la introducción de grupos carbonilo reactivos con un agente oxidante para generar grupos aldehído en presencia de iones borato cuando se realiza la reacción en disolvente acuoso; reaccionando a continuación dichos grupos con el espaciador diamino-alquilo en presencia de un agente reductor, o mediante

Vacunas de polisacárido y glucoconjugado mejoradas.

Antecedentes

Las vacunas de glucoconjugados datan su desarrollo industrial para utilización humana después de 1990, basándose en estudios teóricos y modelos moleculares originalmente descritos entre 1929 y 1940. Estos estudios fueron reevaluados y puestos de manifiesto a nivel molecular en la década de 1980 a 1990, aprovechándose de las metodologías más recientes en desarrollo en la era biotecnológica.

La estrategia de utilizar como vacuna un antígeno semisintético que conlleva un carbohidrato unido por enlace covalente a una proteína portadora, ha tenido la base experimental en la demostración de que el sistema inmunitario de lactantes humanos no está completamente maduro hasta los 2 años de edad, de modo que los antígenos de polisacárido muy purificados no son reconocidos de manera eficaz como antígenos extraños por el hospedador humano. Como resultado, una cantidad adecuada de anticuerpo IgG funcional y no anestésico no sigue a la inyección de varias inyecciones de polisacárido. La proteína portadora no desempeña la función de activar propiamente y reforzar la población de linfocitos T cooperadores del sistema inmunitario del hospedador que da como resultado a continuación la expansión de anticuerpos IgG del suero que segregan linfocitos B con memoria específicos para el polisacárido transportado así como para la proteína portadora. El impacto de las vacunas de glucoconjugado en la Salud Pública desde el principio de los noventa, ha sido inapreciable ya que han salvado millones de vidas de niños en situación de riesgo de infecciones agudas mortales, como la meningitis medular debida a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (S. pneumoniae, H. influenzae o N. meningitidis).

Varias estrategias de conjugación química son conocidas para preparar industrialmente un antígeno de conjugado proteína-carbohidrato. Las técnicas conocidas no son satisfactorias en cuanto a rendimientos cuantitativos.

El documento EP 0306607A da a conocer la desintoxicación de LPS por hidrólisis del lípido A que produce polisacárido exento de lípido A. El polisacárido obtenido de este modo y la proteína se activan a continuación y se acoplan para producir vacunas para bacterias Gram-negativas.

Según un aspecto, la presente solicitud se refiere a un procedimiento de preparación que proporciona:

Según un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos de purificación y/o conjugación como se describe a continuación en la presente memoria y se reivindica en las reivindicaciones adjuntas. En particular, una forma de realización de la presente invención proporciona un procedimiento de conjugación que implica las etapas siguientes:

Preferentemente los antígenos de polisacárido se purifican mediante un procedimiento que implica la eliminación de la endotoxina contaminante mediante el enlace por afinidad de la fracción lípido A de LPS con los péptidos anti-endotoxina sintéticos (SAEP) con secuencias de aminoácido retroinvertidas, que producen un polisacárido que tiene un contenido de endotoxina convenientemente inferior a 0,125 unidades de endotoxina/μg de polisacárido, equivalente a menos de 0,00125% (p/p), citado en las reivindicaciones como polisacárido exento de endotoxina.

Procedimiento preferido para preparar vacunas de glucoconjugado

Esta etapa produce un antígeno de polisacárido de pureza excepcionalmente elevada, que impide la posibilidad real de conjugarse con la proteína portadora, además de con el polisacárido, el LPS contaminante. De hecho, las preparaciones utilizadas actualmente de polisacáridos que se originan a partir de la cápsula de las bacterias Gram-negativas, pueden contener una cantidad de LPS igual o inferior a 25 UE/μg de polisacárido (unidades de endotoxina/mCg). Este límite es requerido por las Farmacopeas Oficiales que emiten las especificaciones del producto. Dado que 1 UE/ml detectada por el análisis del LAL (Limulus Amoebocyte Lysate) iguala a una media de 100 pg/ml de LPS purificada, en 1 μg de antígeno de polisacárido existe una cantidad de LPS contaminante de 2,5 ng. Dado el hecho de que la dosis inmunizante para personas está comprendida en el intervalo entre 25 y 50 μg para el polisacárido capsular purificado y entre 10 a 25 μg para el polisacárido capsular conjugado, se puede calcular que el hospedador está recibiendo entre 62,5 y 125 ng de LPS/dosis de polisacárido capsular en la vacuna anterior y entre 25 y 62,5 ng de LPS/dosis de polisacárido conjugado en la vacuna última.

Estas concentraciones de impurezas de LPS presentes en los productos disponibles en el mercado, cuando se expresan en peso para lactantes y niños (de 4 a 8 kg de peso corporal medio entre los 3 y 24 meses de edad) que son las poblaciones destinatarias de las vacunas glucoconjugadas, corresponden y superan el umbral de pirogenicidad determinado recientemente para LPS en personas (concentraciones de suero entre 1 y 2 ng de LPS/kg de peso corporal después de la administración i.v.). La inyección de una dosis de 25 a 50 μg de vacuna de polisacárido, que contiene entre 62,5 y 125 ng de LPS contaminante, introduce realmente en el hospedador humano del lactante una cantidad de LPS contaminante comprendida en el intervalo entre 15 y 30 ng/kg. En el caso de un glucoconjugado, estas cifras se calculan en el intervalo entre 6 y 15 ng/kg.

Esta observación explica la razón de por qué se describen efectos pirógenos, esporádicos, aunque detectables, después de la inmunización con vacunas de polisacárido capsular (en forma de polisacárido libre o polisacárido conjugado), aunque los efectos secundarios generales... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de conjugación que implica las etapas siguientes:

2. Procedimiento de conjugación según la reivindicación 1, en el que dicho antígeno del polisacárido exento de endotoxina se prepara mediante la eliminación de la endotoxina contaminante mediante el enlace por afinidad de la fracción lípido A de LPS con péptidos anti-endotoxina sintéticos (SAEP) que presentan secuencias de aminoácido retroinvertidas.

3. Vacuna que contiene uno o más antígenos de glucoconjugado preparados según la reivindicación 1, que se administra por vía s.c., i.m. o i.d. en la dosis comprendida entre 0,1 y 100 μg, en una sola o múltiples inyecciones.

4. Formulación para vacuna que contiene uno o más antígenos de glucoconjugado preparados según la reivindicación 1.

5. Procedimiento para preparar un antígeno de polisacárido exento de endotoxina (LPS) conjugado con una proteína portadora que comprende las etapas siguientes:

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha etapa A comprende el desacoplamiento O-de-hidrógeno mediante la introducción de grupos carbonilo reactivos con un agente oxidante para generar grupos aldehído en presencia de iones borato, reaccionando a continuación dichos grupos con un espaciador diamino-alquilo en presencia de un agente reductor.

7. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha etapa A comprende un enlace del espaciador diamino-alquilo con los restos carbonilo reactivos en forma de grupos carboxilo por carbodiimida insoluble en agua, en presencia de un disolvente orgánico.

8. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la activación de la proteína inmunógena portadora de la etapa B es llevada a cabo mediante los ésteres monosuccinimidílicos de los restos de lisina de la proteína.

9. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el acoplamiento de la etapa C se lleva a cabo mediante los ésteres monosuccinimidílicos de los restos de lisina de la proteína y los grupos amino del polisacárido.

10. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el acoplamiento de la etapa C se lleva a cabo mediante un éster bis-succinimidílico de un ácido bicarboxílco alifático que reacciona sucesivamente con 1) un grupo amino del polisacárido amino-activado y 2) con los grupos epsilon-amino de los restos de lisina de la proteína.

11. Conjugado de un antígeno de polisacárido exento de endotoxina (LPS) con una proteína portadora, que puede obtenerse mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Vacuna que comprende un conjugado de un antígeno de polisacárido exento de endotoxina (LPS) con una proteína portadora según la reivindicación 11.

13. Vacuna según la reivindicación 12, en la que los polisacáridos tienen un contenido en endotoxina inferior a 0,125 unidades de endotoxina/μg de polisacárido, equivalente a menos de 0,00125 (p/p).

14. Vacuna según la reivindicación 12, que comprende un antígeno glucoconjugado específico para Neisseria meningitidis del grupo A.

15. Vacuna según la reivindicación 12, que comprende un antígeno glucoconjugado específico para Neisseria meningitidis del grupo C.

16. Vacuna según la reivindicación 12, que comprende un antígeno glucoconjugado específico para Neisseria meningitidis del grupo W135.

17. Vacuna según la reivindicación 12, que comprende un antígeno glucoconjugado específico para Neisseria meningitidis del grupo Y.

18. Vacuna según la reivindicación 12, que comprende múltiples antígenos glucoconjugados específicos para Neisseria meningitidis de los grupos A, C, W135 e Y.

19. Vacuna según la reivindicación 12, que comprende múltiples antígenos glucoconjugados específicos para Streptococcus pneumoniae de los grupos 3, 4, 6, 7, 9, 11, 12, 14, 18, 19 ó 23.

20. Vacuna según la reivindicación 12, que comprende un antígeno glucoconjugado específico para Haemophilus influenzae de tipo B.

21. Vacuna según la reivindicación 12, que comprende un antígeno glucoconjugado específico para Salmonella typhi.

22. Vacuna según la reivindicación 12, que comprende un antígeno glucoconjugado específico para Vibrio cholerae.