Utilización de células dendríticas (CD) que expresan interleucina 12 (IL-12).

Células dendríticas (CD) activas que liberan interleucina 12 (IL-12) que se cargan con un antígeno contra un tumor específico para su utilización en el tratamiento de un paciente que padece dicho tumor específico,

caracterizadas porque las CD se cargan con el antígeno contra el tumor específico y se tratan a continuación con lipopolisacárido (LPS) e interferón gamma (IFN-γ) a fin de obtener CD específicas del tumor que liberan de IL-12.

Utilización de células dendríticas (CD) que expresan interleucina 12 (IL-12) .

La presente invención se refiere a la utilización de células dendríticas (CD) que expresan interleucina 12 (IL-12) .

Aunque se ha producido un progreso considerable en el desarrollo de técnicas de identificación de antígenos asociados a tumores, a menudo los métodos tradicionales para la administración de dichos antígenos son toscos e inadecuados. Muchos adyuvantes en principio disponibles han sido descubiertos empíricamente y no se conoce bien su mecanismo de acción estimuladora del sistema inmunitario. Además, los estudios preclínicos han sugerido que muchos adyuvantes convencionales facilitan la generación de algún tipo de respuesta inmunitaria pero no desencadenan otras armas importantes del sistema inmunitario, como la actividad de los CTL. Particularmente, no se ha podido lograr ninguna generación de inmunidad citolítica antitumoral mediante tales adyuvantes.

Esto ha conducido a la aplicación de las CD como adyuvantes. En dichos experimentos, las CD cargadas in vitro con un antígeno asociado a tumor han provocado el rechazo del tumor en sistemas tumorales de ratón experimentales y ha aumentado la inmunidad antitumoral en los pacientes. Las CD capturan y procesan antígenos en la periferia, migran a los órganos linfoides, expresan moléculas coestimuladoras de linfocitos y segregan citocinas a fin de iniciar y guiar las respuestas inmunitarias.

El antígeno es presentado por las CD en moléculas CMH de clase I y clase II, que se unen a péptidos durante su maduración biosintética, proporcionando de este modo una representación continuamente actualizada de la composición proteínica intracelular y ambiental. Los receptores de linfocitos T presentes en los linfocitos T citotóxicos (CTL) reconocen péptidos antigénicos unidos a moléculas CMH de clase I, mientras que los complejos peptídicos de CMH de clase II son reconocidos por los linfocitos T cooperadores (HTL) .

Algunos estímulos de maduración producen una polarización de HTL de tipo 1 caracterizada por la liberación de IL12 [Cella, 1996], que posteriormente estimula el desarrollo de la inmunidad citolítica. Otros, por el contrario, no lo hacen y favorecen la polarización de HTL de tipo 2, que estimulan la inmunidad humoral. Los lipopolisacáridos (LPS) son estímulos de maduración clásicos que dan lugar a la secreción de IL-12 por parte de las CD [Hilkens, 1997].

Sin embargo, se ha demostrado [Langenkamp, 2000] que, tras la maduración con LPS, las CD producen IL-12 sólo temporalmente y resultan resistentes a una estimulación adicional. El agotamiento de la producción de citocinas afecta al proceso de polarización de los linfocitos T. Poco después de la estimulación, las CD estimulan fuertes respuestas de HTL de tipo 1, mientras que más tarde las mismas células estimulan preferentemente los HTL de tipo 2.

En el documento WO 01/39600 A1, se ha descrito el uso de Hsp27 como agente antiinflamatorio utilizado para la maduración de las CD. Sin embargo, dichas CD no están cargadas con un antígeno tumoral, sino que el contacto con el antígeno más bien tiene lugar únicamente después de que se haya producido la maduración. Por lo tanto, en dicho documento no puede tener lugar ninguna carga de antígeno antes de la maduración.

En el documento WO 01/09288 A1, las CD se preparan por ejemplo mediante la adición de TNF alfa en el medio de cultivo. Sin embargo, es conocido el hecho de que el TNF alfa no estimula la molécula heterodimérica completa de IL-12, sino únicamente una de las dos subunidades. Además, según el documento WO 01/09288 A1, el contacto con el antígeno se hace efectivo únicamente después de la maduración de las CD, de modo que las células descritas en dicho documento no se cargan en ningún caso contra un patógeno o un tumor específicos.

En el documento WO 02/34887 A2, se utilizan dos clases diferentes de adyuvantes de ácidos nucleicos, en concreto CpG por un lado y poli I:C por otro, para estimular las CD. Sin embargo, es conocido el hecho de que los poli I:C y los CpG pueden liberar IL-12 en CD humanas únicamente con una eficiencia muy baja. Además, en dicho documento no se describe ninguna "carga" específica de patógeno o de tumor de las CD junto con la liberación de IL-12.

En el documento WO 01/51077 A1 se describen métodos para la regulación de la producción de IL-12 por parte de agonistas y antagonistas de CCR5, aunque tampoco en este caso se utilizan CD específicamente "cargadas".

En Wang y otros (Zhonghua xue ye xue za zhi, 21 (7) , (2000) , pág. 345-348) se describe que la proliferación de células CD (4) (+) tras el cultivo con CD debe ser un buen indicador como instrumento para verificar el progreso de una inmunoterapia. Se cargaron CD de PBMC con un antígeno tumoral de la línea celular XG-7, que a continuación podía estimular más células CD (4) (+) que CD. Sin embargo, dicho documento no describe la administración de ningún estímulo de maduración.

En Felzmann y otros (Cancer Lett. 168 (2001) , 145-154) se dan a conocer unos métodos para la maduración de las CD mediante exposición a CD40L o LPS. En Rieser y otros (Urol. Int. 63 (1999) , 151-159) se describen CD maduras y la inducción de respuestas inmunitarias en pacientes con carcinoma de células renales metastásico. En Felzmann y otros (Cancer Lett. 161 (2000) , 241-250) se describe la carga de toxoide tetánico en líneas celulares linfoblastoides. En Banchereau y otros (Nature 392 (1998) , 245-252) se repasan las CD y el control de la inmunidad. En Gitlitz y otros (Curr. Urol. Rep. 2 (2001) , 46-52) se describe una inmunoterapia del carcinoma de células renales basada en CD. En Hilkens y otros (Blood 90 (1997) , 1920-1926) se da a conocer que las CD requieren factores inductores de IL-12 exógenos para dirigirse al fenotipo Th1.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención consiste en dar a conocer unos medios mejorados para el tratamiento de infecciones víricas y tumores utilizando CD.

Así, la presente invención da a conocer células dendríticas activas (CD) liberadoras de interleucina 12 (IL-12) que se cargan con un antígeno contra un tumor específico para su utilización en el tratamiento de un paciente que padece dicho tumor específico, caracterizándose dichas CD porque se cargan con el antígeno contra el tumor específico y a continuación se tratan con lipopolisacárido (LPS) e interferón gamma (IFN-y) a fin de obtener CD específicas del tumor liberadoras de IL-12.

Aunque es conocido que es posible inducir la liberación de IL-12 en las CD, este concepto no se consideró adecuado ni necesario para el tratamiento de pacientes con tumores o para el tratamiento de pacientes que padecen infecciones víricas graves. Esto fue debido principalmente a que la liberación de IL-12 de las CD es temporal y, por consiguiente, adecuada para inducir una respuesta inmunitaria celular suficiente contra el tumor o el patógeno únicamente durante un intervalo de tiempo limitado. Sorprendentemente, mediante la presente invención se ha podido poner de manifiesto que la aplicación de este concepto, que consiste en desencadenar la secreción de grandes cantidades de IL-12 por parte de CD, por ejemplo mediante exposición a una combinación de LPS e IFN-y en medio de cultivo sin suero de ternera fetal, da lugar a una estabilización de la enfermedad durante un período prolongado sin efectos secundarios tóxicos notables. Sin embargo, es importante administrar las CD según la presente invención en un estado en el que la liberación de IL-12 siga teniendo lugar, es decir inmediatamente después de la preparación de las CD liberadoras de IL-12 específicas del tumor o el patógeno o, por lo menos, al cabo de entre 1 y 10 horas, particularmente al cabo de entre 2 y 6 horas, idealmente al cabo de aproximadamente 2 horas de haber terminado la preparación. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a un método para la administración de las CD según la presente invención en una cantidad eficaz a un paciente que padece un tumor o a un paciente infectado con el patógeno específico.

Efectivamente, el tratamiento dado a conocer con la presente invención es bien tolerado. Por consiguiente, la presente invención ha podido demostrar que dichas CD activas, a diferencia de las CD agotadas que ya no producen IL-12, son capaces de inducir inmunidad citolítica en un modelo humano in vitro y rechazo del tumor en un modelo tumoral de ratón. En el apartado de ejemplos de la presente... [Seguir leyendo]

1. Células dendríticas (CD) activas que liberan interleucina 12 (IL-12) que se cargan con un antígeno contra un tumor específico para su utilización en el tratamiento de un paciente que padece dicho tumor específico, caracterizadas porque las CD se cargan con el antígeno contra el tumor específico y se tratan a continuación con lipopolisacárido (LPS) e interferón gamma (IFN-y) a fin de obtener CD específicas del tumor que liberan de IL-12.

2. CD activas según la reivindicación 1, caracterizadas porque dicho tratamiento se lleva a cabo tras un trasplante de médula ósea.

3. CD activas según la reivindicación 1 o 2, caracterizadas porque dicho tumor específico es un tumor maligno avanzado.

4. CD activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas porque dichas CD son CD que han sido extraídas del paciente que padece dicho tumor específico o del donante de médula ósea.

5. CD activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizadas porque las CD se han cargado con un antígeno procedente de una célula tumoral de dicho paciente que padece dicho tumor específico.

6. CD activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizadas porque las CD se cargan adicionalmente con un antígeno trazador.

7. CD activas según la reivindicación 6, caracterizadas porque dicho antígeno trazador es la hemocianina de lapa californiana (KLH) .

8. CD activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizadas porque las CD se cargan adicionalmente con un adyuvante, particularmente el toxoide tetánico.

9. CD activas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizadas porque las CD se han generado in vitro a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) .

10. Kit que comprende

• LPS,

• IFN-y y

• un antígeno contra un tumor específico

a fin de proporcionar CD específicas de tumor que liberan IL-12 para su utilización en el tratamiento de un paciente que padece dicho tumor específico.

11. Kit según la reivindicación 10, caracterizado porque el antígeno es un antígeno procedente de una célula tumoral de un paciente que padece dicho tumor específico.