Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados de exopolisacáridos nativos (EPS) nativos excretados por bacterias marinas mesófilas procedentes del medio hidrotermal profundo perteneciente al género Alteromonas o Vibrio para utilización como agentes cicatrizantes de los tejido conjuntivos,

en particular de los tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales, siendo dichos derivados susceptibles de obtenerse por el procedimiento que comprende las siguientes etapas:

- una etapa de despolimerización radicalar de dichos EPS nativos, para la obtención de derivados despolimerizados de baja masa molar, inferior o igual a 100.000 g/mol,

- una etapa ulterior de sulfatación de los derivados despolimerizados, eventualmente liofilizados, que comprende la adición de al menos un agente de sulfatación en una cantidad suficiente para obtener 10 derivados polisacarídicos sulfatados que presentan una tasa de sustitución en grupos sulfato comprendida entre el 10 y el 45% en peso respecto del peso total del derivado polisacarídico sulfatado, estando dicha etapa de sulfatación eventualmente seguida por una etapa de diálisis. A

Uso de derivados de exopolisacáridos (EPS) despolimerizados sulfatados, como cicatrizantes.

La presente invención se refiere al uso de derivados polisacarídicos obtenidos a partir de polisacáridos nativos de un tipo particular denominado exopolisacáridos (EPS) , que son excretados por diversas cepas de bacterias marinas mesófilas procedentes del medio hidrotérmal profundo.

Más en particular, la presente invención se refiere a derivados polisacarídicos de baja masa molar y altamente sulfatados, susceptibles de obtenerse por despolimerización radicalar y sulfatación de los exopolisacáridos.

Se conocen ya polisacáridos altamente sulfatados y de baja masa molecular que no se derivan de exopolisacáridos bacterianos. Presentan propiedades interesantes, especialmente como sustancias terapéuticas. Por ejemplo, la heparina, polisacárido sulfatado, es el agente anticoagulante y antitrombótico más utilizado en la prevención y el tratamiento de la trombosis venosa. Las heparinas comercializadas se extraen actualmente de las mucosas intestinales del cerdo. Sin embargo, el uso de estas heparinas de origen animal presenta un riesgo de contaminación por agentes patógenos (por ejemplo el prión) . Con el fin de reducir o evitar el riesgo de contaminación, la identificación de nuevos polisacáridos procedentes de orígenes distintos de los animales aparece como una vía de investigación particularmente prometedora.

Los polisacáridos procedentes de las bacterias, y más particularmente de las bacterias marinas, permiten responder a esta necesidad. El estudio y la explotación de los polisacáridos excretados por las bacterias marinas o expolisacáridos se inscribe, por lo tanto en este eje de investigación, en particular para la concepción de nuevos principios activos o de análogos de moléculas ya existentes.

Un cribado de muestras procedentes del medio hidrotérmal de las profundidades de los océanos ha permitido aislar una gran variedad de cepas bacterianas mesófilas, capaces de producir EPS nativos a presión atmosférica y a temperatura ambiente.

Un pequeño número de EPS nativos ya ha sido objeto de registro de patentes y de publicaciones: por ejemplo, la patente europea EP 975 791 describe la cepa Vibrio diabolicus, el EPS HE 800 nativo y su uso como medicamento, en particular como agente retroviral, antitumoral y antitrombótico. En estado nativo, el EPS HE 800 de 800 000 g/mol no está sulfatado; está constituido aproximadamente por el 30% en peso de osamina, el 32% en peso de osas ácidas y el 1% en peso de osas neutras; su contenido en proteínas es próximo al 1% en peso. La solicitud de patente europea Nº 1 296 695 describe el uso del EPS HE 800 en su forma nativa como material que facilita la cicatrización ósea (Zanchetta et al., Calcif Tissue Int, 2003, 72: 74-79) .

Un segundo EPS nativo denominado GY 785 y producido por la bacteria Alteromonas infernus igualmente se ha identificado y descrito en la patente francesa FR 2.755.142. El EPS GY 785 nativo está constituido por una población heterogénea de cadenas polisacaridas de masa molecular media superior a 106 g/mol. El EPS GY 785 nativo está poco sulfatado (tasa de sulfato inferior al 10% en peso) ; está constituido del 57 % en peso de osas neutras (glucosa y galactosa mayoritariamente) y del 42% de osas ácidas (ácido glucurónico y ácido galacturónico) ; no comprende osaminas ni sustituyentes acetato, lactato, piruvato y succinato; su contenido de proteína es de aproximadamente un 4% en peso (Guezennec J., Ind. Microb. Biotech., 2002, 29, 204-208) .

Un tercer EPS nativo denominado ST 716 y producido por la bacteria Alteromonas macleodii subsp. fijiensis se ha identificado y descrito también en la patente europea EP 117125 (Rougeaux H et al., Carohydr. Res., 1998, 312: 5359) . El EPS ST 716 nativo está poco sulfatado (su tasa de sulfato es aproximadamente del 5% en peso) ; está constituido por el 40% en peso de osas neutras y el 40% en peso de osas ácidas; su contenido en proteínas es del 2 al 4% en peso.

Otros EPS nativos nuevos también han sido identificados y descritos en la bibliografía; especialmente el EPS HYD 721 producido por una Pseudoalteromonas (Rougeaux H et al., Carbohydr Res. , 1999, 315 : 273-285 y Raguenes G. et al., 1997) , el EPS HYD 657 (Cambon-Bonavita M et al., J Applied Microbio, 2002, 93 : 310-315) y el EPS MS 907 (Raguenes G et al., Curr Microbiol, 2003, 46 : 448-52) .

La presente invención tiene como objeto derivados polisacarídicos sulfatados procedentes del tratamiento de EPS nativos excretados por cepas bacterianas mesófilas procedentes del medio hidrotermal profundo y con un interés farmacéutico, cosmético o de ingeniería tisular para su uso como agentes cicatrizantes. Los derivados polisacarídicos sulfatados de exopolisacáridos (EPS) nativos excretados por bacterias marinas mesófilas procedentes del medio hidrotermal profundo según la invención son susceptibles de obtenerse por el procedimiento que comprende las siguientes etapas:

- Una etapa de despolimerización radicalar de dichos EPS nativos, para la obtención de derivados despolimerizados de baja masa molar, inferior o igual a 100.000 g/mol,

- Una etapa ulterior de sulfatación de derivados despolimerizados, eventualmente liofilizados, que comprende la adición de al menos un agente de sulfatación en una cantidad suficiente para obtener derivados

polisacarídicos sulfatados que presentan una tasa de sustitución en grupos sulfato comprendida entre el 10 y el 45% en peso respecto del peso total del derivado polisacarídico sulfatado, estando dicha etapa de sulfatación eventualmente seguida por una etapa de diálisis.

Durante la primera etapa de despolimerización, el EPS nativo se puede utilizar bajo una forma líquida, es decir tal como es excretado por las bacterias en el medio de cultivo. De preferencia, el medio de cultivo se centrifuga, y solo el sobrenadante que contiene el EPS nativo y desprovisto de restos bacterianos se conserva. El EPS nativo se puede recoger por cualquier técnica apropiada bien conocida por el experto en la técnica, en particular por ultrafiltración por membrana y, a continuación, ser eventualmente liofilizado tal cual o en forma de una sal de adición.

La etapa de despolimerización por vía radicalar del EPS nativo se realiza de preferencia mediante la adición de una solución de un agente oxidante a una mezcla de reacción que comprende el EPS nativo preferiblemente en presencia de un catalizador metálico. El agente oxidante se elige preferiblemente entre los peróxidos, en particular el peróxido de hidrógeno y los peracidos en particular el ácido peracético y ácido 3-cloroperbenzoico; Efectuándose preferiblemente la adición en continuo y con agitación durante un periodo comprendido entre 30 minutos y 10 horas. Manteniéndose preferiblemente la mezcla de reacción a un pH comprendido entre 6 y 8 mediante la adición continua de un agente alcalinizante tal como la sosa, a una temperatura comprendida entre 30 y 70ºC aproximadamente durante toda la duración de la reacción de despolimerización radicalar.

Según un modo de realización particular de la presente invención, durante esta etapa el EPS nativo está presente en la mezcla de reacción a una concentración comprendida entre aproximadamente 2 y 10 mg/ml de mezcla de reacción.

Según otro modo de realización particular de la presente invención el agente oxidante es una solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) que presenta preferiblemente una concentración comprendida entre 0, 1% y 0, 5% en peso aproximadamente, preferiblemente del orden de 0, 1 a 0, 2% en peso, y que se añade a un caudal comprendido entre, de V1/1000 a V1/10 ml/minuto, preferiblemente V1/50 y V1/500 ml/min. , muy preferiblemente del orden de V1/100 ml/minuto, siendo V1 el volumen del medio de reacción que contiene un exopolisacárido (EPS) marino al cual se añade una solución de peróxido de hidrógeno.

Los catalizadores metálicos utilizables en la etapa de despolimerización se eligen preferiblemente entre los iones Cu++, Fe++, Cr+++ y el anión Cr2O72-tales como se describen especialmente en la solicitud de patente EP-A

0.221.977. Según un modo de empleo particular de la presente invención, el catalizador metálico está presente en la mezcla de reacción a una concentración comprendida entre 10-3 M y 10-1 M aproximadamente, y aún más preferiblemente a una concentración comprendida entre 0, 001 y 0, 05 M aproximadamente.

El procedimiento de despolimerización radicalar según... [Seguir leyendo]

1. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados de exopolisacáridos nativos (EPS) nativos excretados por bacterias marinas mesófilas procedentes del medio hidrotermal profundo perteneciente al género Alteromonas o Vibrio para utilización como agentes cicatrizantes de los tejido conjuntivos, en particular de los tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales, siendo dichos derivados susceptibles de obtenerse por el procedimiento que comprende las siguientes etapas:

- una etapa de despolimerización radicalar de dichos EPS nativos, para la obtención de derivados despolimerizados de baja masa molar, inferior o igual a 100.000 g/mol,

- una etapa ulterior de sulfatación de los derivados despolimerizados, eventualmente liofilizados, que comprende la adición de al menos un agente de sulfatación en una cantidad suficiente para obtener derivados polisacarídicos sulfatados que presentan una tasa de sustitución en grupos sulfato comprendida entre el 10 y el 45% en peso respecto del peso total del derivado polisacarídico sulfatado, estando dicha etapa de sulfatación eventualmente seguida por una etapa de diálisis. A

2. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según la reivindicación 1, caracterizados porque el procedimiento comprende, además, una etapa de reducción que sucede a la etapa de despolimerización radicalar.

3. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque el procedimiento comprende, además, una etapa de Ndesacetilación de los derivados polisacarídicos obtenidos al final de la etapa de despolimerización y/o al final de la etapa de reducción.

4. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque el procedimiento comprende, además, una etapa de liofilización de los derivados polisacarídicos , después de la despolimerización, y/o después de la reducción y/o después de la N-desacetilación y/o antes o después de la sulfatación.

5. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según la reivindicación 1, caracterizados porque la primera etapa de despolimerización radicalar se realiza por adición de una solución de un agente oxidante, de preferencia elegido entre los iones Cu++, Fe++, Cr+++ y el anión Cr2O72-.

6. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según la reivindicación 5, caracterizados porque dicho agente oxidante es una solución de peróxido de hidrógeno, de preferencia de concentración comprendida entre el 0, 1% y el 0, 5% en peso, que se añade a un caudal comprendido entre VI/1000 y V1/10 ml/minuto, de preferencia de V1/50 a V1/500 ml/minutos, siendo V1 el volumen del medio de reacción que contiene un exopolisacárido (EPS) marino excretado por bacterias marinas mesófilas procedentes del medio hidrotermal profundo al que se añade la solución de peróxido de hidrógeno.

7. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizados porque el o los agentes de sulfatación utilizados para la etapa de sulfatación se eligen entre los complejos de piridina sulfato, trietilamina sulfato, dimetilamina sulfato, o trimetilamina sulfato.

8. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizados porque, para la realización de la etapa de sulfatación, el o los agentes de sulfatación química se añaden en una cantidad ponderal que representa de 4 a 6 veces la masa de los derivados polisacarídicos en solución y se añaden a los EPS despolimarizados que están en forma seca o en forma de solución en un disolvente de preferencia anhidro.

9. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizados porque presentan un índice de polidispersidad inferior a 5, de preferencia comprendido entre 1, 5 y 4 y una tasa de sustitución en grupos sulfato comprendida entre el 10 y el 45% en peso y de preferencia comprendida entre el 20 y el 45% en peso, inclusivo.

10. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según la reivindicación 9, caracterizados porque presentan una masa molar inferior o igual a 25.000 g/mol, un índice de polidispersidad inferior a 2, una tasa de sustitución en grupos sulfato comprendido entre 10 y 45% en peso, y de preferencia comprendida entre 20 y 40% en peso, inclusivo.

11. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizados porque las bacterias del género Alteromonas son de la cepa GY 785.

12. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizados porque las bacterias del género Alteromonas se seleccionan entre las cepas HYD 657, HYD 708, HYD 721, HYD 1545, HYD 1644, ST 716 y MS 907.

13. Derivados polisacarídicos sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizados porque las bacterias del género Vibrio son bacterias de la cepa HE 800.

14. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizados porque dichos exopolisacáridos (EPS) nativos excretados por bacterias del género Alteromonas tienen una composición osídica, que comprende:

del 20 al 70%, de preferencia del 30 al 60% y más de preferencia del 38% al 57% en peso de osas neutras.

del 5 al 60%, de preferencia del 6 al 50% y más de preferencia del 8% al 42% en peso de osas ácidas.

del 0 al 1% en peso de osaminas.

15. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, caracterizados porque dichos exopolisacáridos (EPS) marinos excretados por bacterias del género Vibrio tienen una composición osídica que comprende:

Del 0 a 5% de preferencia del 0 al 1% en peso de osas neutras, del 20 al 50%, de preferencia del 25 al 40%, y más de preferencia del 30 al 32% en peso de osas ácidas, del 20 al 50%, de preferencia del 25 al 40%, y de preferencia del 30 al 35% en peso de osaminas, y del 0 al 15%, de preferencia del 4 al 8%, y más de preferencia del 5 al 6% en peso de grupos N-acetilados.

16. Derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados para utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque dichos EPS nativos tienen un contenido del 0 al 15%, de preferencia del 0 a 5%, y más de preferencia del 0 al 1% en peso de proteínas.

17. Derivados polisacarídicos para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque dichos derivados polisacarídicos son capaces de estimular la proliferación de los fibroblastos en cultivos bidimensionales o en el seno de tejidos conjuntivos reconstruidos, , en particular de tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales.

18. Derivados polisacarídicos para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque dichos derivados polisacarídicos permiten favorecer la reconstrucción y el remodelaje de los tejidos conjuntivos, en particular de los tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales.

19. Derivados polisacarídicos para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque dichos derivados polisacarídicos son capaces de inhibir la secreción de citoquinas proinflamatorias por los fibroblastos de los tejidos conjuntivos, en particular de los tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales, y particularmente de inhibir la secreción de la interleuquina 1β (IL-1β) y/o el TNF-α.

20. Derivados polisacarídicos para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque dichos derivados polisacarídicos son capaces de inhibir la secreción de metaloproteasas matriciales por los fibroblastos de los tejidos conjuntivos, en particular de los tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales y particularmente de inhibir la secreción de la gelatinasa A (MMP-2) y de la estromelisina 1 (MMP-3) .

21. Derivados polisacarídicos para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque dichos derivados polisacarídicos son capaces de inhibir la vía clásica del complemento.

22. Derivados polisacarídicos para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque dichos derivados polisacarídicos se utilizan para tratar patologías inflamatorias, como patologías infecciosas, neoplásticas o autoinmunes que afectan a los tejidos conjuntivos, en particular los tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales.

23. Derivados polisacarídicos para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque dichos derivados polisacarídicos son capaces de estimular la proliferación de fibroblastos en detrimento de los miofibroblastos.

24. Derivados polisacarídicos según la reivindicación 23, caracterizados porque dichos derivados polisacarídicos se utilizan para prevenir o tratar los procesos de cicatrización hipertróficos o patologías fibróticas de los tejidos conjuntivos en particular de los tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales.

25. Derivados polisacarídicos para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizados porque dichos derivados polisacarídicos son capaces de estimular selectivamente la proliferación de las células medulares con vocación mesenquimatosa en detrimento de otras subpoblaciones en una población heterogénea de células, en particular en terapia tisular o celular.

26. Composición farmacéutica o medicamento para utilización como cicatrizante de los tejidos conjuntivos, en particular de los tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales, que comprende derivados polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 y un excipiente apropiado.

27. Composición farmacéutica o medicamento para la utilización según la reivindicación 26, caracterizado porque se utiliza en asociación con uno o varios factores de crecimiento presentes en el seno de la composición farmacéutica o presentes en el seno de una composición farmacéutica distinta, siendo dichos factores de crecimientos en particular FGF (Factor de crecimiento de fibroblastos) , TGF, BMP (Proteínas morfogénicas de los huesos) , CTGF (Factor de crecimiento de tejido conectivo) .

28. Composición farmacéutica o medicamento para la utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 27, caracterizado porque se presenta en forma de un gel, una crema, una pomada, una emulsión o una solución.

29. Composición farmacéutica o medicamento para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 27, caracterizado porque se presenta en una forma inyectable, y en la cual dichos derivado polisacarídicos de baja masa molar y sulfatados presentan una masa molar comprendida entre 5.000 y 50.000 g/mol, de preferencia inferior o igual a 25.000 g/mol, un índice de polidispersidad comprendido entre 1, 5 y 5, de preferencia inferior o igual a 2, y una tasa de sustitución en grupos sulfato comprendida entre 10 y 45% en peso, de preferencia comprendida entre 20 y 40% en peso, inclusivo.

30. Dispositivo médico para la utilización como cicatrizante de los tejidos conjuntivos, especialmente de los tejidos conjuntivos dérmicos y gingivales, que comprende derivados polisacáridos de baja masa molar y sulfatados según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

31. Dispositivo médico para la utilización según la reivindicación 30, caracterizado porque es reabsorbible o no, y se elige en el grupo consistente en soportes de liberación retardada, esponjas de disgregación lenta, o implantes quirúrgicos.