TGF{be} y/o Smad3 como marcadores de diagnóstico y/o pronóstico de {al}-sinucleinopatías.

La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico y/o pronóstico de {al}-sinucleinopatías en una muestra obtenida de un paciente que comprende determinar el nivel de expresión del gen TGF{be} y/o Smad3 y/o la actividad de la proteína codificada por dicho gen y comparar dicho nivel con un valor control, donde la alteración de dicho nivel es indicativa de {al}-sinucleinopatía.

TGF~ y/o SMAD3 COMO MARCADORES DE DIAGNÓSTICO Y/O PRONÓSTICO DE a-SINUCLEINOPATíAS

Estado de la técnica

Una característica neuropatológica común de diversas enfermedades neurodegenerativas es el desarrollo de agregados intracelulares de a-sinucleína en poblaciones concretas de neuronas y glia y en zonas discretas, que gradualmente se van ampliando por el Sistema Nervioso, tanto central, periférico como autónomo. Estos agregados anormales de a-sinucleína son los componentes principales de los Cuerpos de Lewy, las neuritas de Lewy y los filamentos de Papp-Lantos en glía y neuronas de la Atrofia Multisistémica, junto a procesos de degeneración neuronal. Su etiología es desconocida y el método de diagnóstico es por evidencia neurológica clínica y mediante análisis post mórtem de tejido nervioso.

Las posibilidades terapéuticas de estos pacientes son muy limitadas y se suelen enfocar en tratamiento sintomático para controlar los problemas motores y psiquiátricos. Sin embargo, la medicación contra las alteraciones motoras puede provocar un cuadro psicótico y alucinatorio importante y, por el contrario, los neurolépticos contra los problemas psiquiátricos empeoran el cuadro motor. Según la sintomatología de cada paciente se utilizan inhibidores de la acetilcolinesterasa, agonistas dopaminérgicos, benzodiacepinas y antidepresivos.

En la actualidad estas enfermedades se diagnostican siguiendo criterios neurológicos, asociados a Resonancia Magnética o Tomografía Computerizada para identificar atrofias de áreas cerebrales. Un diagnóstico confirmatorio definitivo de las asinucleinopatías sólo es posible mediante inspección visual en un examen post mórtem tras inmunohistoquímica para a-sinucleína.

Es necesario, por tanto, identificar nuevos marcadores biológicos de estas enfermedades, que permitan un diagnóstico molecular para su inclusión en la práctica clínica habitual. Al mismo tiempo, la identificación de estos marcadores biológicos permitirá el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un método de diagnóstico y/o pronóstico de asinucleinopatías fácilmente utilizable en la práctica clínica mediante un test sencillo, rápido y económico que permite la determinación en serie de un alto volumen de muestras.

Así, pues, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico y/o pronóstico de a-sinucleinopatías en una muestra obtenida de un paciente que comprende determinar el nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3 y/o la actividad de la proteína codificada por dicho gen y comparar dicho nivel con un valor control, donde la alteración es indicativa de a -sinucleinopatía.

En un aspecto más en particular de la presente invención, la disminución del nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3, y/o de la actividad de la proteína codificada por dicho gen es indicativo de a -sinucleinopatía.

En la presente invención por a-sinucleinopatía nos referimos a (1) enfermedades con presencia de cuerpos y/o neuritas de Lewy, como es el caso de la enfermedad de Parkinson idiopática y algunas formas familiares, la demencia con cuerpos de Lewy, la presencia de cuerpos de Lewy en el envejecimiento y en la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades; (2) la aparición de agregados de a-sinucleína en enfermedades sin cuerpos y/o neuritas de Lewy, como es el caso de la Atrofia Multisistémica y la enfermedad de Hallervorden-Spatz y enfermedades con presencia de agregados de asinucleína en glia u otro tipo celular, tanto del Sistema Nervioso Central, Periférico y Autonómico.

En un aspecto más en particular de la presente invención, el nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3 se determina mediante la medida del ADN, en su totalidad o parcialmente, que codifica para el gen TGF~ y/o Smad3. En un aspecto más en particular, el nivel de expresión de TGF~ y/o Smad3 se determina mediante la medida de ARNm y/o su conversión a ADNc.

En otro aspecto más en particular de la presente invención, la medida de ADN, ARNm

o ADNc se realiza mediante amplificación del ADN, ARNm o ADNc. Más en particular, la amplificación se lleva a cabo mediante PCR, SDA o mediante cualquier otra técnica de amplificación conocida por un experto en la materia que permita una estimación cuantitativa del gen TGF~ y/o Smad3 y su expresión, ya sea mediante técnicas basadas en la ADN polimerasa (como PCR) , o en técnicas basadas en la trascripción (como TMA, NASBA o 3SR) , o en técnicas basadas en el desplazamiento en cadena (como SDA) , o amplificación dependiente de ADN ligasa (como LCR) o métodos de amplificación de la señal (como el bDNA) .

En otro aspecto más en particular de la presente invención, la medida de ADN, de ADNc y/o de ARNm, se lleva a cabo mediante microarrays, o biochips de ADN, con sondas específicas o con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo o sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo.

En otro aspecto más en particular de la presente invención, el nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3 se determina mediante la cuantificación de la cantidad de proteína codificada por dicho gen y/o fragmentos del mismo.

En otro aspecto más en particular, la cantidad de proteína expresada por el gen TGF~ y/o Smad3, o fragmentos, se determina mediante western blot, chips de proteínas, o cualquier otro método que utilice anticuerpos específicos contra TGF~ y/o Smad3. También se incluye la espectrometría de masas, los aptámeros o cualquier otro método cuantitativo de proteínas.

En otro aspecto más en particular de la presente invención, la cantidad de proteína se determina mediante técnicas inmunohistoquímicas e inmunocitoquímicas, técnicas ELlSA o cualquier otro método enzimático, así como técnicas morfométricas, densitométricas, midiendo la intensidad de fluorescencia o cualquier otro método de cuantificación sobre imágenes.

El gen TGF~ y/o Smad3 y/o sus niveles de expresión también pueden determinarse mediante una sustancia indicadora que se una a TGF~ o Smad3 (ADN, ARN o proteína, total o fragmento) . En un aspecto más en particular de la presente invención, la sustancia indicadora es un anticuerpo, oligonucleótido, macromolécula, molécula orgánica o cualquier otra sustancia, que con actividad enzimática, de radioisótopo, un colorante, compuesto fluorescente, quimioluminiscente, bioluminiscente, quelador de metales o cualquier marcador que el estado actual de la ciencia utiliza como método de detección de TGF~ y/o Smad3.

En otro aspecto más en particular de la presente invención, el nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3 se determina mediante la medida de la actividad de la proteína codificada por dicho gen y/o fragmentos de los mismos. En un aspecto más en particular, la medida de la actividad de la proteína se realiza mediante análisis directo

o indirecto de la actividad de TGF~ (entendiendo como tal su activación desde su estado latente, su secreción al medio extracelular o la unión y/o fosforilación a sus receptores transmembranales -T~RI y T~RII-) y/o Smad3 (entendiendo como tal su fosforilación, unión a Smad4, translocación al núcleo o actividad transcriptora mediante unión a ADN) .

En otro aspecto más en particular de la presente invención, la muestra a analizar es seleccionada de entre sangre, suero, tejido, líquido cefalorraquídeo, saliva, orina o cualquier fluido biológico.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al uso del gen TGF~ y/o Smad3 o fragmentos de ellos, así como de la proteína codificada por el gen TGF~ y/o Smad3 para el diagnóstico y/o pronóstico de a-sinucleinopatías.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico y/o pronóstico de a-sinucleinopatías que comprende las sondas, cebadores, aptámeros, sustancias indicadoras y/o anticuerpos necesarios para determinar los niveles de expresión de los genes TGF~ y/o Smad3, mediante el método descrito en la presente invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al uso de un kit según se describe en la presente invención para el diagnóstico y pronóstico de asinucleinopatías

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método de detección in vitro...

1. Método para el diagnóstico y/o pronóstico de a-sinucleinopatías en una muestra obtenida de un paciente que comprende determinar el nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3 y/o la actividad de la proteína codificada por dicho gen y comparar dicho nivel con un valor control, donde la alteración de dicho nivel es indicativa de a sinucleinopatía.

2. Método según la reivindicación 1, donde las a-sinucleinopatías son enfermedades que cursan con agregados de a-sinucleína con cuerpos y/o neuritas de Lewy, con agregados de a-sinucleína sin cuerpos o neuritas de Lewy y con agregados de asinucleína en células gliales o en células del Sistema Nervioso Central, Periférico o Autonómico.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la disminución del nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3 y/o de la actividad de la proteína codificada por dicho gen es indicativa de a-sinucleinopatía.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3 se determina mediante la medida de ADN, ARNm

o ADNc que codifican para los genes TGF~ y/o Smad3 o fragmentos de los mismos.

5. Método según la reivindicación 4, donde la medida de ADN, ARNm o ADNc se lleva a cabo mediante amplificación del ADN, ARNm o ADNc.

6. Método según la reivindicación 5, donde la amplificación del ADN, ARNm o ADNc se lleva a cabo mediante PCR, SDA, TMA, NASBA, LCR, bDNA o 3SR.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 donde la medida de ADN, ADNc o ARNm se lleva a cabo mediante microarrays, biochips de ADN o fotolitografía.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3 se determina mediante la cantidad de proteína codificada por dicho gen y/o fragmentos de los mismos.

9. Método según la reivindicación 8, donde la cantidad de proteína se determina mediante técnicas inmunohistoquímicas, inmunocitoquímicas, técnicas ELlSA, métodos enzimáticos, análisis de imágenes, espectrometría de masas, aptámeros, sustancias indicadoras que se unan a TGF~ y/o Smad3.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la actividad de la proteína codificada por el gen TGF~ y/o Smad3 y/o fragmentos del mismo se realiza mediante análisis directo o indirecto de la actividad de la proteína TGF~ y/o Smad3.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la muestra a

analizar es seleccionada entre sangre, suero, tejido, líquido cefalorraquídeo, saliva u orina o cualquier fluido biológico.

12. Uso del gen TGF~ y/o Smad3 y/o de la proteína codificada por dichos genes para el diagnóstico y/o pronóstico de a-sinucleinopatías.

13. Kit para el diagnóstico y/o pronóstico de a-sinucleinopatías según el método de las

reivindicaciones 1-11, que comprende sondas, cebadores, aptámeros, sustancias indicadoras y/o anticuerpos necesarios para determinar los niveles de expresión del gen TGF~/ Smad3.

14. Uso de un kit según la reivindicación 13 para el diagnóstico y/o pronóstico de asinucleinopatías.

15. Método de detección in vitro de fármacos útiles para el tratamiento de asinucleinopatías que disminuyen los agregados de a-sinucleína en el sistema nervioso caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) medir el nivel de expresión del gen TGF~ y/o Smad3 y/o actividad de las proteínas codificadas por los mismos, 20 b) calcular la diferencia entre los valores en presencia y ausencia del fármaco, c) considerar como fármaco eficaz aquel cuya diferencia sea estadísticamente significativa,