Suplemento de medios de cultivo de mamíferos que comprende albúmina humana recombinante y citrato,

suplemento caracterizado porque:

(a) el suplemento está libre de albúmina humana no recombinante; y

(b) el suplemento es capaz de ayudar a un desarrollo embrionario equivalente al de los embriones cultivados en presencia de albúmina sérica.

Suplemento de medios de cultivo de gametos y de embriones de mamíferos y procedimiento de utilización del mismo

SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a medios de cultivo que proporcionan ambientes útiles para el desarrollo celular. Más particularmente, la presente invención se refiere al suplemento de medio de cultivo definido que comprende constituyentes preparados a partir de fuentes no tradicionales que, cuando se añade al medio de cultivo, supera los problemas de los medios de cultivo anteriores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Durante años los suplementos de medios para cultivar células embrionarias de mamíferos se han derivado de fluidos de animales y en particular del suero de la sangre. Aunque los suplementos de medios de cultivo en base a suero han sido algo eficaces para el cultivo de ciertos tipos de células y tejidos, estos suplementos de medios de cultivo se han encontrado que son indeseables. Una de las principales razones para que estos suplementos de medios de cultivo en base a suero no sean candidatos atractivos para el cultivo de células se debe a la posibilidad de que el medio de cultivo resultante estará contaminado con impurezas, toxinas y agentes infecciosos presentes en el fluido del que se deriva el medio. Además, dado que los animales de donde se colecta la sangre son diferentes y viven en diferentes ambientes, los fluidos producidos por estos animales tienen diferentes componentes a diferentes concentraciones. Se ha reconocido que un aspecto importante de un medio de cultivo basado en suero es que requiere macromoléculas en el medio. En un intento de imitar los productos en base a suero, los investigadores han tratado de añadir macromoléculas sintéticas tal como alcohol polivinílico, para sustituir macromoléculas en el suero tal como albúmina. Sin embargo, como gran parte del suero no está definido químicamente, la eliminación del suero de los medios de cultivo y el intento de sustituir sólo las moléculas más grandes ha producido medios de cultivo que no son ideales o resultan ineficaces para muchos propósitos debido a que están ausentes componentes esenciales del medio.

En consecuencia, existe la necesidad de suplementos de medios de cultivo que sean tan eficaces como los suplementos de medios de cultivo en base a productos sanguíneos y al mismo tiempo eliminar posibles fuentes de contaminación. Además, existe la necesidad de medios de cultivo estandarizados.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un novedoso suplemento completamente definido en base fisiológica para medios de cultivo de células embrionarias y gametos de mamíferos. Este suplemento de medios puede ser utilizado con medios de fertilización in vitro, medios de transferencia de embriones y medios de criopreservación de embriones para la preimplantación de embriones de mamíferos, así como suplemento de medios para el desarrollo de células madre embrionarias, o cualquier otro medio similar, muy conocidos en la técnica. Este suplemento comprende albúmina humana recombinante (AHr) , hialuronano fermentado (HYN) y/o citrato y combinaciones de los mismos. La adición de este suplemento al medio de cultivo da como resultado un desarrollo equivalente comparado con los suplementos de medios con albúmina de suero purificada a partir de la sangre.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El suplemento puede comprender albúmina humana recombinante (AHr) en cualquier concentración adecuada para los medios de cultivo en que se va a utilizar. Tal como se describirá en el presente documento, la utilización de AHr en lugar de la albúmina sérica humana (HSA) de origen natural tiene numerosas ventajas.

Habitualmente, cuando el suplemento comprende AHr, el suplemento comprende, aproximadamente, entre 0, 1 mg/ml y 20, 0 mg/ml de AHr en base al volumen total del medio al que se añade el suplemento. En una realización, se añade aproximadamente entre 0, 5 mg/ml y aproximadamente 5, 0 mg/ml de AHr en base al volumen total del medio.

La eficacia del suplemento se puede mejorar mediante la adición de hialuronano fermentado (HYN) al suplemento. La adición de HYN fermentado al suplemento de medios de cultivo muestra resultados positivos.

La frase "aumenta la viabilidad de gametos o células embrionarias", tal como se utiliza en el presente documento, se define que comprende el desarrollo incrementado en el cultivo de los embriones hasta el estado de blastocistos, incremento de la capacidad de eclosión in vitro de la zona pelúcida y/o un incremento de la viabilidad general del embrión en cultivos de embriones cuando los embriones son cultivados en un medio que comprende el suplemento de la presente invención en comparación con los que se cultivan en el mismo medio sin el suplemento.

Además, la adición de HYN fermentado al medio adecuado afecta significativamente la capacidad de los blastocistos de sobrevivir a la congelación. La utilización de HYN fermentado tiene varias ventajas sobre la utilización de HYN proveniente de fuentes naturales de vertebrados de sangre caliente tales como las purificadas a partir de cresta de gallo o cordón umbilical. Mediante la utilización de HYN fermentado en lugar de HYN proveniente de fuentes de vertebrados de sangre caliente, la capacidad de controlar la seguridad y estabilidad de HYN de diferentes fuentes y lotes es mucho mayor.

Cuando está presente, la cantidad de HYN fermentado, en general, estará en concentraciones aproximadamente, de 0, 1 mg/ml aproximadamente hasta 5, 0 mg/ml en base al volumen total del medio. En una realización, el HYN fermentado se añadirá al medio en concentraciones, aproximadamente, de 0, 125 mg/ml, aproximadamente hasta 1, 0 mg/ml en base al volumen total del medio.

El suplemento puede incrementarse aún más mediante la adición de citrato. En una realización, citrato y AHr se añaden ambos al suplemento del medio, ya que se ha descubierto sorprendente e inesperadamente que la adición de citrato a un suplemento de medios de cultivo que contiene AHr, permite que AHr duplique las propiedades de HSA o albúmina de suero bovino (ASB) . La adición de citrato tiene un efecto adicional de mejora del desarrollo del material celular cultivado. Puede utilizarse cualquier citrato utilizado para medios de cultivo que sea muy conocido en la técnica, incluyendo pero sin constituir limitación, citrato de colina, citrato de calcio, ácido cítrico, citrato de sodio y combinaciones de los mismos. En una realización se utiliza citrato de sodio. El citrato se añade, generalmente, en concentraciones aproximadamente de 0, 1 mM aproximadamente hasta 5, 0 mM, en base al volumen total del medio. En una realización, el citrato se añade a concentraciones aproximadamente de 0, 1 mM aproximadamente hasta 1, 0 mM, en base al volumen total del medio.

El suplemento de medios de cultivo de la presente invención comprende AHr, HYN fermentado y/o citrato en cualquier combinación conveniente. En una realización, el suplemento de medios de cultivo y el medio de cultivo al que se le añade el suplemento, están libres de macromoléculas no recombinantes o macromoléculas purificadas a partir de una fuente animal. En otra realización, el suplemento de medios de cultivo y el medio de cultivo al que se añade el suplemento, están libres de HSA no recombinante y/o HYN no fermentado.

La presente invención se refiere al suplemento de medios de cultivo descrito anteriormente, al medio de cultivo que comprende el suplemento de medios de cultivo, a un procedimiento de preparación del suplemento de medios de cultivo, a kits que comprenden el suplemento de medios de cultivo. También se da a conocer un procedimiento de crecimiento de material embrionario empleando el suplemento de medios de cultivo descrito en el presente documento.

En una realización con embriones se describe un procedimiento de crecimiento de material celular empleando el suplemento de medios de cultivo descrito en el presente documento de manera que pueden ser incluidos en el medio al comienzo del cultivo o pueden añadirse mediante alimentación por lotes o de manera continua. Además, los componentes del suplemento de medios de cultivo pueden añadirse juntos o por separado, en diferentes etapas de la preparación del medio de cultivo.

Este suplemento se puede añadir a cualquier medio de cultivo de material celular de mamífero adecuado muy conocido en la técnica, comprendiendo pero sin constituir limitación a, medios de cultivo de embriones, medios de transferencia de embriones y medios de criopreservación... [Seguir leyendo]

1. Suplemento de medios de cultivo de mamíferos que comprende albúmina humana recombinante y citrato, suplemento caracterizado porque:

(a) el suplemento está libre de albúmina humana no recombinante; y

(b) el suplemento es capaz de ayudar a un desarrollo embrionario equivalente al de los embriones cultivados en presencia de albúmina sérica.

2. Suplemento, según la reivindicación 1, que además comprende hialuronano fermentado.

3. Suplemento, según la reivindicación 1, en el que el suplemento está libre de una o más macromoléculas no recombinantes, hialuronano derivado de un vertebrado de sangre caliente y combinaciones de los mismos.

4. Preparación que comprende el suplemento según la reivindicación 1 y un medio de cultivo seleccionado del grupo que comprende un medio de transferencia de embriones, un medio de criopreservación de embriones y un medio de fertilización in vitro.

5. Preparación que comprende albúmina humana recombinante, citrato y un medio de cultivo, preparación

caracterizada porque:

(a) la preparación está libre de albúmina humana no recombinante; y

(b) la preparación es capaz de aumentar la viabilidad de gametos o células embrionarias.

6. Preparación, según la reivindicación 5, que comprende de 0, 1 mg/ml a 20 mg/ml de albúmina humana recombinante.

7. Preparación, según la reivindicación 5, que comprende aproximadamente de 0, 5 mg/ml aproximadamente hasta 5, 0 mg/ml de albúmina humana recombinante.

8. Preparación, según la reivindicación 5, que comprende además hialuronano fermentado.

9. Preparación, según la reivindicación 5, en la que está presente citrato en un intervalo aproximadamente de 0, 1 mM aproximadamente hasta 1, 0 mM en base al volumen total de la preparación.

10. Preparación, según la reivindicación 9, en la que está presente hialuronano fermentado en un intervalo aproximadamente de 0, 1 mg/ml, aproximadamente hasta 1, 0 mg/ml en base al volumen total de la preparación.

11. Preparación, según la reivindicación 5, en la que el medio de cultivo se selecciona del grupo que comprende G1.2/G2.2, KSOM/KSOMaa, M16, SOF/SOFaa, MTF, P1, HTF, Earle´s, Hams F-10, M2, Hepes-G1.2, Whitten´s y PBS.

12. Preparación, según la reivindicación 5, en la que la preparación es capaz de aumentar la viabilidad de los embriones.

13. Preparación, según la reivindicación 5, en la que la preparación es capaz de proporcionar un desarrollo embrionario equivalente comparado con el de los embriones cultivados en presencia de albúmina sérica.

14. Preparación, según la reivindicación 5, en la que la preparación es capaz de aumentar la capacidad de los blastocistos de sobrevivir a la congelación y descongelación.

15. Preparación, según la reivindicación 5, en la que la preparación es capaz de ayudar al desarrollo embrionario desde la etapa de blastocistos hasta la eclosión.

16. Preparación que esencialmente comprende:

(a) un medio de cultivo;

(b) albúmina humana recombinante en una cantidad aproximadamente desde 0, 1 mg/ml aproximadamente hasta 20, 0 mg/ml;

(c) hialuronano fermentado en una cantidad aproximadamente desde 0, 1 mg/ml aproximadamente hasta 5, 0 mg/ml; y

(d) citrato en una concentración aproximadamente desde 0, 1 mM aproximadamente hasta 5, 0 mM, en la que la preparación es capaz de ayudar al desarrollo celular embrionario o de gametos y además en la que la preparación está libre de albúmina humana no recombinante.

17. Preparación, según la reivindicación 16, en la que el medio de cultivo se selecciona del grupo que comprende G1.2/G2.2, KSOM/KSOMaa, M16, SOF/SOFaa, MTF, P1, HTF, Earle´s, Hams F-10, M2, Hepes-G1.2, Whitten´s y PBS.

18. Preparación, según la reivindicación 16, en la que la preparación está libre de una o más macromoléculas no recombinantes, albúmina humana no recombinante, hialuronano derivado de vertebrados de sangre caliente y combinaciones de los mismos.

19. Suplemento que esencialmente comprende: 10

(a) albúmina humana recombinante en una cantidad aproximadamente desde 0, 125 mg/ml aproximadamente hasta 20, 0 mg/ml;

(b) hialuronano fermentado en una cantidad aproximadamente desde 0, 1 mg/ml aproximadamente hasta 5, 0 mg/ml; y

(c) citrato en una concentración aproximadamente desde 0, 1 mM aproximadamente hasta 5, 0 mM, en el que el medio de cultivo que comprende el suplemento es capaz de ayudar al desarrollo celular embrionario o de gametos y además en el que el suplemento está libre de albúmina humana no recombinante.