Soportes sólidos funcionalizados para dendrímeros fosforados, procedimiento para su preparación y sus aplicaciones.

Un soporte sólido caracterizado porque comprende al menos una superficie funcionalizada de maneracovalente por dendrímeros fosforados que poseen un núcleo central que contiene al menos dos grupos funcionales yque incluyen en su periferia varios grupos funcionales capaces de permitir la fijación de dichos dendrímeros sobredicha superficie,

así como la fijación o síntesis in situ de moléculas de interés, dichos dendrímeros que tienen untamaño comprendido entre 1 y 20 nm, y caracterizado porque los dendrímeros se seleccionan entre aquellosconstituidos por:

- una capa central en forma de núcleo central P0, que opcionalmente contiene fósforo, que comprende de 2 a 12grupos funcionalizados,

- n capas intermedias, iguales o diferentes, cada una de dichas capas intermedias que está compuesta de unidadesP1 que se corresponden con la fórmula (I) siguiente:**Fórmula**

en la que:

L es un átomo de oxígeno, fósforo, azufre o nitrógeno.

Soportes sólidos funcionalizados para dendrímeros fosforados, procedimiento para su preparación y sus aplicaciones

La presente invención se refiere a soportes sólidos funcionalizados por dendrímeros fosforados, a su procedimiento de preparación, a su utilización para la preparación de biochips y a las aplicaciones de estos biochips, en particular para la inmovilización de macromoléculas, especialmente macromoléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, lípidos, proteínas (péptidos, enzimas, anticuerpos, etc.) o sus pares moleculares.

El desarrollo exponencial de la genómica y de la farmacogenómica relacionado no solamente con la secuenciación del genoma humano, sino también con el de los animales, bacterias, virus, plantas, etc. ha llevado a los laboratorios de investigación académicos o industriales a la utilización masiva de biochips fiables y fáciles de fabricar.

Sin embargo, en este caso particular, es primordial poder disponer de soportes sólidos funcionalizados que presenten un cierto número de características.

En particular, estos soportes deben permitir la inmovilización reproducible de moléculas de interés, en la medida en que una inmovilización reproducible es imperativa para una detección también reproducible.

Asimismo estos soportes deben permitir la inmovilización de moléculas de interés de manera sensible. La sensibilidad de un soporte sólido funcionalizado depende del grado de inmovilización y del procedimiento de detección de una señal, pero también y sobre todo del nivel de ruido de fondo (señal no especifica) . Una disminución del ruido de fondo mejora la relación señal/ruido. De hecho, en el dispositivo en el que se detecta la presencia de

especies biológicas en las proximidades de la superficie, el ruido de fondo proviene esencialmente de la adsorción no específica de moléculas, incluso moléculas biológicas de interés marcadas y que en consecuencia conviene limitar. Lo ideal por tanto es obtener un soporte que tenga un ruido de fondo muy bajo y una elevada intensidad de detección de la señal.

Por otra parte, y especialmente en el caso particular de las reacciones de hibridación que utilizan ácidos nucleicos, el acoplamiento de las sondas a la superficie de un soporte sólido debe garantizar la integridad de la secuencia y la estabilidad del depósito. Después de la etapa de hibridación, los resultados deben ser reproducibles de un soporte a otro. Para este propósito, las sondas deben estar separadas de la superficie del soporte sólido con el fin de no perturbar la hibridación con los ácidos nucleicos diana. Esto permite una aproximación a las condiciones de

hibridación en disolución simulando una hibridación en tres dimensiones en lugar de las dos dimensiones obtenidas convencionalmente mediante la técnica del portaobjetos de vidrio. Para evitar los impedimentos estéricos entre el ADN y la superficie del soporte es necesario un espaciador de al menos unos 40 átomos (4 – 5 nm) .

Por otra parte, es importante poder disponer de soportes sólidos funcionalizados reutilizables. La posibilidad de

poder disponer de un soporte reutilizable es de un gran interés puesto que permite el análisis de varias muestras biológicas con un único dispositivo, lo que permite llevar a cabo comparaciones cuantitativas. Además, los soportes reutilizables permiten la realización de varias mediciones sobre una misma muestra y así posibilita la mejora de los resultados desde un punto de vista estadístico.

45 Hasta el momento, se han propuesto diferentes tipos de procedimientos de preparación de biochips.

Los biochips, y en particular los biochips de ácidos nucleicos, se pueden fabricar por síntesis in situ o por inmovilización de sondas.

50 En el primer caso (síntesis in situ) , las sondas son oligonucleótidos que se sintetizan directamente sobre el soporte paso a paso y que tienen un tamaño comprendido generalmente entre 20 y 30 bases. Este procedimiento de fabricación permite tener acceso a chips de alta densidad (McGall y col., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 5081 – 5090) .

55 En el segundo caso (inmovilización de sondas) , las sondas se sintetizan previamente y a continuación se inmovilizan sobre el soporte. Por tanto pueden entrar en juego dos tipos de interacciones con la superficie.

La sonda de ácidos nucleicos se puede mantener sobre la superficie por interacciones electrostáticas entre los grupos fosfato del esqueleto cargados negativamente y la superficie modificada del soporte cargada positivamente.

A modo de ejemplo, este tipo de biochips se pueden obtener recubriendo la superficie con poli-L-lisina o por silanización con un aminosilano (Zammatteo y col., Anal. Biochem., 2000, 280, 143 – 150; Eisen y col., Methods in Enzymol, 1999, 303, 179 – 205) . En este tipo de inmovilización, generalmente la sonda está tendida sobre el soporte, lo que puede causar problemas de accesibilidad durante la etapa de hibridación. Además, esta forma de

interacciones iónicas no es suficientemente estable para permitir la reutilización del biochip.

La sonda de ácidos nucleicos también puede estar injertada sobre el soporte mediante interacciones covalentes. En general, las uniones entre las sondas y el soporte se establecen a través de uno de los extremos 3' o 5' del ácido nucleico, lo que permite la accesibilidad de la sonda a lo largo de toda su longitud con una mejor calidad de 10 respuesta en términos de hibridación. Se pueden encontrar diversas combinaciones en la funcionalización del soporte y de los ácidos nucleicos. El soporte puede incluir, por ejemplo, grupos funcionales nucleófilos tales como -NH2 o -SH y el ácido nucleico a injertar incluye por tanto un grupo funcional electrófilo tal como por ejemplo un grupo funcional -CHO, -NCS, -NHS o incluso -COOR, y viceversa. De acuerdo con otra variante, el soporte y el ácido nucleico pueden ser nucleófilos y un espaciador dielectrófilo permitirá el acoplamiento entre las dos entidades. Por

último, el soporte y la sonda pueden ser electrófilos y el acoplamiento se llevará a cabo gracias a un espaciador dinucleófilo.

Los biochips fabricados en la actualidad se producen, en su gran mayoría, utilizando vidrio como soporte.

Los más utilizados cuentan con superficies funcionalizadas con un espaciador terminado por un grupo funcional -NH2. Su eficacia en términos de acoplamiento e hibridación ha sido confirmada, pero no es posible la reutilización de este tipo de portaobjetos ya que las interacciones entre las sondas y el soporte son de tipo iónico.

Se comercializan otros portaobjetos que tienen en su superficie grupos funcionales aldehído. Estos grupos

funcionales se introducen mediante la utilización de un silano-aldehído, un espaciador simple, que sólo presenta un único grupo funcional de anclaje por molécula que se encuentra del lado del soporte o del lado de los ácidos nucleicos. Sin embargo se ha demostrado que el anclaje en varios puntos de la superficie es importante (Zhao y col., Nucl. Acids Res., 2001, 29, 955 – 959; solicitud internacional WO 01/51689) puesto que permite asegurar el incremento de los sitios de fijación de las sondas sobre el soporte, que da como resultado una mejor respuesta en

términos de hibridación.

Otra forma de obtener una mejor sensibilidad de detección está presente, en particular, en el trabajo de M. Beier y

J.D. Hoheisel, Nucl. Acids Res., 1999, 27, 1970 – 1977. Los autores construyeron, sobre un portaobjetos de vidrio, moléculas ramificadas de seis ramas con el objetivo de aumentar la densidad de las sondas. La naturaleza de estos 35 espaciadores ramificados también permite modular la naturaleza hidrófila o hidrófoba de la superficie. Su procedimiento de preparación incluía un total de ocho etapas de síntesis, a partir de un portaobjetos aminado, para obtener el biochip, lo que limita enormemente su desarrollo industrial. Además, las moléculas ramificadas se generan in situ de forma no controlada y su estructura no está definida, por lo que no se puede garantizar la homogeneidad de la superficie del biochip obtenido de esta forma. Al ser todos los enlaces covalentes, los autores

demostraron que sus biochips se podían reutilizar. Cabe señalar que la reutilización de biochips... [Seguir leyendo]

1. Un soporte sólido caracterizado porque comprende al menos una superficie funcionalizada de manera covalente por dendrímeros fosforados que poseen un núcleo central que contiene al menos dos grupos funcionales y

que incluyen en su periferia varios grupos funcionales capaces de permitir la fijación de dichos dendrímeros sobre dicha superficie, así como la fijación o síntesis in situ de moléculas de interés, dichos dendrímeros que tienen un tamaño comprendido entre 1 y 20 nm, y caracterizado porque los dendrímeros se seleccionan entre aquellos constituidos por:

- una capa central en forma de núcleo central P0, que opcionalmente contiene fósforo, que comprende de 2 a 12 grupos funcionalizados,

- n capas intermedias, iguales o diferentes, cada una de dichas capas intermedias que está compuesta de unidades

P1 que se corresponden con la fórmula (I) siguiente: 15

en la que:

L es un átomo de oxígeno, fósforo, azufre o nitrógeno,

M representa uno de los grupos siguientes:

un grupo aromático no sustituido, di-, tri-o tetra-sustituido con grupos alquilo, grupos alcoxi, grupos insaturados del 25 tipo olefínico C1-C12, azo, acetilénico, todos ellos que pueden o pueden no incorporar átomos de fósforo, oxígeno, nitrógeno, azufre o halógenos, o

un grupo alquilo o alcoxi que tiene varios sustituyentes como se define para M cuando es un grupo aromático,

R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan un átomo de hidrógeno o uno de los siguientes grupos: alquilo, alcoxi, arilo, que contienen o no contienen átomos de fósforo, oxígeno, azufre, nitrógeno o halógeno, siendo R2 lo más habitualmente diferente de R1,

n es un número entero comprendido entre 1 y 11,

E es un átomo de oxígeno, azufre o nitrógeno, en donde dicho átomo de nitrógeno puede estar unido a un grupo alquilo, alcoxi o arilo, todos ellos que pueden o pueden no incorporar átomos de fósforo, oxígeno, nitrógeno, azufre o halógenos,

- una capa externa compuesta de unidades P2, iguales o diferentes, y que se corresponden con la siguiente fórmula II:

45 en la que: W es uno de los siguientes grupos: alquilo, alcoxi, arilo, todos estos grupos que contienen o no contienen átomos de fósforo, oxígeno, nitrógeno, azufre o halógenos,

X representa un grupo aldehído, tiol, amina, epóxido, ácido carboxílico, alcohol o fenol.

2. Soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el núcleo central P0 se selecciona del grupo constituido por el grupo con la fórmula general IIIa:

y el grupo con la fórmula general IIIb:

en la que R5 representa un átomo de azufre, oxígeno o nitrógeno.

3. Soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los dendrímeros se seleccionan entre los compuestos en los que el grupo con la fórmula (I) representa el grupo siguiente:

en la que R2 representa un radical alquilo C1-C12 y más en particular un radical metilo; y el grupo con la fórmula (II) representa uno de los dos grupos siguientes:

y en las que el número de generaciones varía preferentemente entre 1 y 6.

4. Soporte sólido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado

porque se selecciona entre los soportes que contienen al menos una superficie silicificada tales como portaobjetos, perlas y capilares de vidrio, soportes de silicio o de plástico y soportes metálicos.

5. Procedimiento de preparación de un soporte sólido como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende una etapa de formación de un enlace covalente entre los

dendrímeros fosforados que poseen un núcleo central que contiene al menos dos grupos funcionales, dichos dendrímeros que comprenden en su periferia varias funciones capaces de permitir su fijación sobre dicha superficie y la fijación o la síntesis in situ de moléculas de interés, y la superficie funcionalizada o no de un soporte sólido para obtener un soporte sólido funcionalizado de forma covalente mediante dichos dendrímeros.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque los dendrímeros comprenden en su periferia grupos funcionales que permiten el acoplamiento directo mediante un enlace covalente de estos últimos sobre la superficie no funcionalizada previamente de dicho soporte sólido.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque los dendrímeros comprenden en su periferia grupos funcionales tiol y porque el soporte sólido comprende una superficie de oro.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la superficie del soporte sólido utilizado no

comprende funciones compatibles con las funciones periféricas del dendrímero utilizado, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) la funcionalización de al menos una superficie de un soporte sólido por funciones capaces de permitir la fijación de dendrímeros fosforados que poseen un núcleo central que contiene al menos dos grupos funcionales, dichos 15 dendrímeros que comprenden en su periferia varias funciones capaces de permitir su fijación sobre dicha superficie funcionalizada de esta manera, y la fijación o la síntesis in situ de moléculas de interés;

b) la eventual preactivación de los grupos funcionales del soporte para obtener una superficie funcionalizada activada,

c) la formación de un enlace covalente entre dichos dendrímeros y dicha superficie funcionalizada y eventualmente activada, para obtener un soporte sólido funcionalizado de manera covalente mediante dichos dendrímeros.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa a) de funcionalización

de la superficie del soporte sólido se lleva a cabo por silanización mediante un reactivo de silanización que comprende funciones capaces de fijar los dendrímeros, tales como por ejemplo grupos funcionales amina.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque el reactivo de silanización

está aminado. 30

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la etapa de preactivación se lleva a cabo por tratamiento del soporte con ayuda de un agente basificante, durante un periodo comprendido entre los 2 y los 20 minutos.

12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, caracterizado porque la etapa de fijación covalente de los dendrímeros, consiste en:

- preparar una disolución de dichos dendrímeros en un disolvente,

- poner en contacto dicha disolución de dendrímeros con la superficie eventualmente funcionalizada y eventualmente activada, durante un periodo comprendido entre 10 minutos y 24 horas.

13. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, caracterizado porque

tras la finalización de la etapa de fijación covalente de los dendrímeros, los soportes se enjuagan y se secan. 45

14. Utilización de un soporte sólido funcionalizado para los dendrímeros fosforados como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, como soporte para la inmovilización y/o la síntesis in situ de moléculas de interés.

50 15. Utilización de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque las moléculas de interés son moléculas de ácidos nucleicos, lípidos, proteínas o sus pares moleculares.

16. Biochip o dendrichip caracterizado porque está constituido de un soporte sólido que comprende al

menos una superficie funcionalizada por los dendrímeros fosforados y como se han definido en una cualquiera de 55 las reivindicaciones 1 a 4, sobre los que se fijan, de manera covalente, moléculas de interés.

17. Biochip de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque es reutilizable.

18. Procedimiento de preparación de un biochip como se ha definido en la reivindicación 16 ó 17,

caracterizado porque consiste en la puesta en contacto de un soporte sólido que tiene al menos una superficie funcionalizada por dendrímeros fosforados y que comprenden en su periferia funciones capaces de permitir la fijación covalente de moléculas de interés con una disolución tampón que contiene las moléculas de interés que se han funcionalizado previamente con, o que ya contienen, uno o varios grupos funcionales capaces de formar un

enlace covalente con dichas funciones periféricas de los dendrímeros.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque las funciones periféricas de los dendrímeros utilizados son funciones aldehído, y porque las moléculas de interés se han funcionalizado previamente con, o ya contienen, una o varias funciones amina, o se han funcionalizado previamente con una o

varias funciones oxiamina (-ONH2) o hidrazina (-NH-NH2) .

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque las moléculas de interés han sido previamente funcionalizadas con, o ya contienen, una o varias funciones amina, y que a la etapa de fijación de las moléculas de interés le sigue una etapa de reducción de las funciones imina.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque las funciones periféricas de los dendrímeros utilizados son funciones tiol, y porque las moléculas de interés se han funcionalizado previamente con, o ya contienen, una o varias funciones tiol o se han funcionalizado previamente con una o varias funciones yodoacetamida (-NHCO-CH2-I) .

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque las funciones periféricas de los dendrímeros utilizados son funciones amina, y porque las moléculas de interés se han funcionalizado previamente con, o ya contienen, una o varias funciones aldehído, a-oxoaldehído, -COOR, -NCS, o -NHS.

23. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque las funciones periféricas de los dendrímeros utilizados son funciones epóxido, y porque las moléculas de interés se han funcionalizado previamente con, o ya contienen, una o varias funciones amina.

24. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, caracterizado porque la

reacción de fijación covalente de las moléculas de interés sobre los dendriportas se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 4 y 50 °C, durante un periodo comprendido entre 2 y 24 horas.

25. Utilización de un dendrichip de acuerdo con la reivindicación 16 o 17 como chips de ADN, de péptidos, de polipéptidos o de proteínas.