Sistema y procedimiento de diagnóstico por imagen microscópica multifotónica fibrada de una muestra.

Sistema de diagnóstico por imagen multifotónica fibrada de una muestra (10),

este sistema consta de:

- un láser (2) pulsado para generar un haz láser de excitación multifotónica,

- una guía de imagen (8) constituida por una pluralidad de fibras ópticas, que permiten iluminar la muestra(10) por un barrido punto por punto, y

- medios de barrido (5) para dirigir por turno el haz láser de excitación en una fibra de la guía de imagen (8),Sistema caracterizado porque consta además de:

- medios de compensación (4) para compensar efectos de dispersión de velocidad de grupo y efectos nolineales de los impulsos de excitación en la guía de imagen (8), estos medios están dispuestos entre elláser pulsado (2) y la guía de imagen (8) la dispersión lineal y los efectos no lineales en la guía de imagen(8) modifican el perfil temporal y espectral del impulso de excitación que vuelve a ser sensiblementeidéntico al perfil (18) del impulso saliente del láser, de modo que

los medios de compensación que constan de un trozo de fibra óptica seguido por una línea dispersiva, eltrozo de fibra óptica está constituido por una única fibra óptica monomodo, el diámetro del modo de estafibra monomodo es superior al diámetro del modo de los núcleos de la guía de imagen, este trozo de fibraestá dispuesto para hacer aparecer efectos no lineales de ensanchamiento espectral, la línea dispersivaestá dispuesta para introducir un índice de dispersión de velocidad anormal de grupo, retrasando losfotones más rojos del espectro láser de modo que el impulso (19) saliente de la línea dispersiva sea máslargo que el del (18) saliente del láser.

Sistema y procedimiento de diagnóstico por imagen microscópica multifotónica fibrada de una muestra [0001] La invención presente se refiere a un sistema y un procedimiento para realizar una imagen microscópica multifotónica fibrada de una muestra, para una utilización en endoscopia o en microscopia de fluorescencia. El campo de aplicación al que se aspira es más particularmente el del diagnóstico por imagen in vivo e in situ.

En diagnóstico por imagen de fluorescencia confocal convencional, un fotón excita a una molécula. La desexcitación de esta última provoca la radiación de un fotón fluorescente. La energía del fotón excitador corresponde exactamente a la cantidad de energía necesaria para llevar a la molécula a un estado excitado determinado. La fuente utilizada es un láser que emite fotones excitadores en el visible (entre aproximadamente 400 nm y 650 nm) . En microscopia multifotónica, es decir microscopia por fluorescencia no lineal, y más particularmente en microscopia bifotónica, la cantidad de energía necesaria para la transición es aportada, no por un fotón excitador, sino por dos fotones (o más en diagnóstico por imagen multifotónica) , cada uno presentando una energía dos veces (o más) inferior a la del fotón excitador convencional. En efecto, utilizamos fotones excitadores en el infrarrojo próximo (700 nm a 1000 nm) que son menos energéticos que los fotones excitadores en el caso convencional. No obstante, el fotón fluorescente emitido por la molécula es idéntico al emitido en el caso convencional.

En microscopia bifotónica (o multifotónica) los mecanismos que implican dos (o más) fotones tienen una eficacia que es proporcional al cuadrado (o más) de la intensidad instantánea de la fuente de excitación. Una gran eficacia de excitación sólo puede ser alcanzada gracias a fuertes restricciones espaciales y temporales. La restricción espacial implica un buen enfoque del haz excitador en el tejido, sea una fuerte densidad espacial de los fotones en el volumen focal de irradiación. La microscopia bifotónica presenta pues una ventaja superior que es su confocalidad natural ya que toda la fluorescencia detectada sólo proviene del volumen elemental excitado en profundidad. La fluorescencia emitida no es una integral del volumen comprendido entre la superficie de la muestra y el volumen elemental excitado; esto permite particularmente limitar cualquier problema de fotoblanqueo de los fluoróforos situados entre la superficie y el plano de enfoque. La restricción temporal implica una fuente láser que genera impulsos ultra cortos y muy intensos, sea una fuerte densidad temporal de los fotones en el volumen focal de irradiación.

Por otro lado, frente a las normas de irradiación la microscopia bifotónica es importante porque el infrarrojo próximo engendra menos interacción de los fotones con la materia, y una excitación pulsada con pulsos ultracortos reduce considerablemente los problemas vinculados a la fototoxicidad.

Un inconveniente en microscopia lineal de fluorescencia fibrada reside en el hecho de que la distancia de penetración del haz excitador en la muestra es débil, inferior a una centena de micrómetros. Un aumento de la potencia de estos haces para mejorar la distancia de penetración provocaría ciertamente daños fisiológicos, particularmente por el hecho de que generalmente está en régimen casi-continuo. Así, órganos dispuestos más profundamente en la muestra no son accesibles. La microscopia bifotónica permite paliar este inconveniente ya que permite una distancia de penetración teórica superior a 400 micrómetros. En efecto, los fotones de excitación, situados en el infrarrojo próximo, son menos energéticos individualmente, poco absorbidos por el tejido que está esencialmente compuesto por agua y por tanto poco destructores en comparación con los utilizados en fluorescencia lineal.

Los sistemas de microscopia bifotónica corrientemente utilizados son microscopios de mesa como por ejemplo un microscopio vertical constituido por una placa óptica en altura que lleva dispositivos de barrido y de detección para la constitución de imágenes. Dicho sistema de obtención no puede aplicarse particularmente a la endoscopia in vivo in situ. En efecto, un microscopio de mesa es a menudo embarazoso, utiliza objetivos clásicos para la iluminación y la captura de la señal, supone tener al animal bajo el objetivo, y requiere mucho tiempo de integración (garantía de una gran sensibilidad) .

Conocemos el documento GB2338568, de Optiscan, "Two-photon endoscope or microscope method and apparatus" que propone un dispositivo de microscopia bifotónica. Este dispositivo utiliza una sola fibra óptica para transportar los impulsos del láser hacia la muestra. Con el fin de limitar el fenómeno de dispersión lineal y no lineal de los impulsos en la fibra óptica, se divulgan medios de compensación particularmente por prismas.

El documento US6369928, de Optical Biopsy Technologies, describe un microscopio de barrido de fluorescencia bifotónica para la obtención de una imagen microscópica. Este microscopio contiene por lo menos dos fibras ópticas: cada una utilizada como fuente y también como receptor del haz de fluorescencia obtenido por iluminación de la otra fibra óptica. En particular, dos características de este sistema constituyen restricciones para una miniaturización: 1) el barrido se hace del lado distal de las fibras, es decir entre las fibras y la muestra; 2) ambos haces incidentes respetan un ángulo de incidencia en la muestra, por tanto una separación entre las fibras.

El documento JP 2003 344777 describe un dispositivo de diagnóstico por imagen que consta de un microscopio multifotónico y una guía de imagen constituida por una pluralidad de fibras ópticas.

El documento US 6 249 630 B1 describe un dispositivo para proporcionar a un aparato óptico pulsos ópticos, dicho dispositivo es capaz de compensar efectos de dispersión.

El documento " Distortion-free deliver y of nanojoule femtosecond pulses from a Ti:sapphire laser through a hollow-core photonic cr y stal fiber ", publicado en la revista "Optics Letters" vol. 29, Nº 11, página 1285, describe una fibra óptica no dispersiva.

El documento titulado "Reverse Propagation of femtosecond pulses in optical fibers" de Tsong y col. (Optics letters, vol. 28, p. 1873 a 1875) se refiere a un método numérico de cálculo de forma de pulso en la entrada de un sistema óptico para obtener otra forma de pulso derivado en la salida de este sistema óptico.

La invención presente tiene por objeto un nuevo sistema de microscopia multifotónico miniaturizado particularmente para una aplicación en endoscopia. Otro objetivo de la invención es un nuevo sistema de microscopia multifotónico que permite la obtención de una imagen en profundidad de la muestra.

Se alcanza por lo menos uno de los objetivos mencionados anteriormente con un sistema de diagnóstico por imagen multifotónico de fibra según la reivindicación 1.

Preferentemente, para alcanzar profundidades importantes, el sistema consta de una cabeza óptica para enfocar el haz láser de excitación saliente de la guía de imagen en la muestra.

Preferentemente, las dimensiones de la cabeza óptica y de la guía de imagen deben ser suficientes para que puedan deslizarse fácilmente en un canal operador.

El sistema según la invención permite la realización de una imagen de fluorescencia in vivo, in situ, desviada con una resolución microscópica. La guía de imagen o “fiber bundle” en lengua inglesa presenta una flexibilidad y un tamaño que permite una aplicación en endoscopia particularmente por inserción en un canal operador.

Según una característica ventajosa de la invención, pueden contemplarse diferentes medios de compensación, como por ejemplo:

- Una única fibra óptica que permite optimizar la respuesta de la guía de imagen, esta única fibra óptica que está asociada a una línea dispersiva que contiene por lo menos dos prismas o dos redes de difracción, de tal modo que los desfases introducidos por esta única fibra óptica y la guía de imagen son compensados por el desfase provocado por la línea dispersiva;

Estos dispositivos de compensación también pueden servir para compensar dispersiones producidas por otro elemento (cabeza óptica, lentes, espejos, etc.) del sistema.

Según la invención, prevemos medios de inyección dispuestos del lado próximo a la guía de imagen y que permiten enfocar por turno el haz láser de excitación en una fibra determinada de la guía de imagen. También prevemos primeros medios de detección para detectar una señal de fluorescencia que proviene de la muestra.... [Seguir leyendo]

rEIVINDICACIONES

1. Sistema de diagnóstico por imagen multifotónica fibrada de una muestra (10) , este sistema consta de:

-un láser (2) pulsado para generar un haz láser de excitación multifotónica,

-una guía de imagen (8) constituida por una pluralidad de fibras ópticas, que permiten iluminar la muestra

(10) por un barrido punto por punto, y

-medios de barrido (5) para dirigir por turno el haz láser de excitación en una fibra de la guía de imagen (8) , Sistema caracterizado porque consta además de:

-medios de compensación (4) para compensar efectos de dispersión de velocidad de grupo y efectos no lineales de los impulsos de excitación en la guía de imagen (8) , estos medios están dispuestos entre el láser pulsado (2) y la guía de imagen (8) la dispersión lineal y los efectos no lineales en la guía de imagen

(8) modifican el perfil temporal y espectral del impulso de excitación que vuelve a ser sensiblemente idéntico al perfil (18) del impulso saliente del láser, de modo que los medios de compensación que constan de un trozo de fibra óptica seguido por una línea dispersiva, el trozo de fibra óptica está constituido por una única fibra óptica monomodo, el diámetro del modo de esta fibra monomodo es superior al diámetro del modo de los núcleos de la guía de imagen, este trozo de fibra está dispuesto para hacer aparecer efectos no lineales de ensanchamiento espectral, la línea dispersiva está dispuesta para introducir un índice de dispersión de velocidad anormal de grupo, retrasando los fotones más rojos del espectro láser de modo que el impulso (19) saliente de la línea dispersiva sea más largo que el del (18) saliente del láser.

2. Sistema según la reivindicación 1, caracterizado porque la línea dispersiva contiene por lo menos dos prismas (26, 27; 32, 33, 34, 35) .

3. Sistema según la reivindicación 1, caracterizado porque la línea dispersiva contiene por lo menos dos redes de difracción (23, 24; 28, 29, 30, 31) .

4. Sistema según la reivindicación 1, caracterizado porque la línea dispersiva contiene por lo menos dos prismas (26, 27; 32, 33, 34, 35) , la única fibra óptica monomodo (37) está asociada con la línea dispersiva de tal modo que los desfases provocados por esta única fibra óptica (37) y la guía de imagen (8) se compensen por el desfase provocado por la línea dispersiva.

5. Sistema según la reivindicación 1, caracterizado porque la línea dispersiva contiene por lo menos dos redes de difracción (23, 24; 28, 29, 30, 31) , la única fibra óptica monomodo (37) está asociada a la línea dispersiva de tal modo que los desfases provocados por esta única fibra óptica (37) y la guía de imagen (8) se compensan por el desfase provocado por la línea dispersiva.

6. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la línea dispersiva es acabada por un espejo por encima del cual está dispuesta una máscara de fase y de amplitud (36) .

7. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los medios de compensación (4) están integrados en los medios de barrido (5) .

8. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el láser pulsado (2) y los medios de compensación (4) son sintonizables en longitud de onda.

9. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque consta además de medios de inyección dispuestos en el lado próximo de la guía de imagen (8) y que permiten enfocar por turno el haz láser de excitación en una fibra determinada de la guía de imagen (8) .

10. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque consta además de primeros medios de detección para detectar una señal de fluorescencia que proviene de la muestra (10) .

11. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque consta además de un filtro dicroico apto que dirige las señales procedentes de la muestra (10) hacia medios de detección.

12. Sistema según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho filtro dicroico está dispuesto entre los medios de barrido (5) y la guía de imagen (8) .

13. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el láser pulsado (2) es un láser femtosegundo.

14. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el láser pulsado (2) es un láser picosegundo.

15. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la guía de imagen (8) está compuesta por una pluralidad de fibras ópticas monomodos ordenadas.

16. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque consta de una cabeza óptica (9) para enfocar el haz láser de excitación saliente de la guía de imagen (8) en la muestra (10) .

17. Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la guía de imagen (8) está constituida por varios millares de fibras ópticas y no tiene cabeza óptica, de modo que los extremos distales de la guía de imagen (8) están dispuestos para colocarse al descubierto directamente en contacto con la superficie de la muestra (10) .

18. Procedimiento de diagnóstico por imagen multifotónica fibrada de una muestra (10) , en el cual se genera un haz láser de excitación multifotónico por un láser pulsado (2) , que consta de las etapas siguientes:

- se barre la muestra (10) dirigiendo por turno el haz láser de excitación en una fibra de una guía de imagen

(8) constituida por una pluralidad de fibras ópticas,

- se ilumina la muestra (10) por un barrido punto por punto a partir del haz láser de excitación que proviene de la guía de imagen (8) , y

- se detecta una señal de fluorescencia emitida por la muestra (10) caracterizado porque consta además de las etapas siguientes:

- se hace pasar el haz láser de excitación por medios de compensación (4) dispuestos entre el láser pulsado (2) y la guía de imagen (8) para compensar efectos de dispersión de velocidad de grupo y efectos no lineales de los impulsos de excitación en la guía de imagen (8) , la dispersión lineal y los efectos no lineales en la guía de imagen (8) modificando el perfil temporal y espectral del impulso de excitación que vuelve a ser sensiblemente idéntico al perfil (18) del impulso saliente del láser, los medios de compensación constan de un trozo de fibra óptica seguido por una línea dispersiva, el trozo de fibra óptica está constituido por una única fibra óptica monomodo, el diámetro del modo de esta fibra monomodo es superior al diámetro del modo de los núcleos de la guía de imagen, este trozo de fibra hace aparecer efectos no lineales de ensanchamiento espectral, la línea dispersiva introduce un índice de dispersión de velocidad anormal de grupo, retrasando los fotones más rojos del espectro láser de modo que el impulso (19) saliente de la línea dispersiva sea más largo que el del (18) saliente del láser.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque se detecta el conjunto de la señal de fluorescencia saliente de la guía de imagen (8) .