PROCEDIMIENTO Y EQUIPO DE PROCESAMIENTO DE IMÁGENES DE FLUORESCENCIA DE ALTA RESOLUCIÓN POR FIBRA ÓPTICA Y PARTICULARMENTE DE PROCESAMIENTO DE IMÁGENES CONFOCAL.

Procedimiento para realizar una imagen confocal de fluorescencia in vivo in situ,

el procedimiento utiliza una guía de imagen hecha de varios millares de fibras ópticas y consiste en barrer punto por punto un tejido en un plano subsuperficial, cada punto correspondiente a una señal de excitación emitida por una fuente continua, desviada e inyectada en una de las fibras ópticas de dicho haz luego enfocada a la salida de dicha fibra en dicho plano, cada punto emitiendo de vuelta una señal de fluorescencia recogida por dicha fibra óptica, luego detectada y digital izada para formar un elemento de imagen, el procedimiento comporta las siguientes etapas: - se desvía la señal de excitación a una velocidad que corresponde a la adquisición de un mínimo de 12 imágenes por segundo en el caso de un modo de visualización máxima de 640 x 640 píxeles, - se detecta la señal de fluorescencia a una frecuencia de detección superior o igual a una frecuencia mínima de preparación de muestreo de las fibras una por una que es sensiblemente igual a 1,5 MHz para dicho mínimo de 12 imágenes por segundo en el caso de un modo de visualización de 640 x 640 píxeles

Procedimiento y equipo de procesamiento de imágenes de fluorescencia de alta resolución por fibra óptica y particularmente de procesamiento de imágenes confocal.

La presente invención se refiere a un procedimiento y un equipo de procesamiento de imágenes de fluorescencia fibrada de alta resolución, particularmente confocal. El campo de aplicación aludido es más particularmente el del procesamiento de imágenes in vivo e in situ.

La fluorescencia observada puede provenir de un compuesto exógeno (normalmente un marcador inyectado) o endógeno (presente en la célula) de un tejido biológico.

Más particularmente, el procedimiento de procesamiento de imágenes confocal según la invención es del tipo que consiste en barrer punto por punto un tejido en un plano subsuperficial, cada punto correspondiente a una señal de excitación emitida por una fuente continua, desviada e inyectada por turnos en una fibra óptica de un haz de fibras ópticas, luego enfocada a la salida de dicha fibra en dicho plano, cada punto emitiendo a cambio una señal de fluorescencia recogida por dicha fibra óptica, luego detectada y digitalizada para formar un elemento de imagen.

El carácter confocal se obtiene utilizando el mismo camino óptico, particularmente la misma fibra óptica que sirve de filtración espacial, para transportar la señal de excitación y la señal de fluorescencia emitida en reacción, y utilizando un sistema óptico que permita conjugar el punto de focalización en el tejido con dicha fibra óptica.

El equipo de procesamiento de imágenes confocal correspondiente comprende el haz de fibras ópticas flexibles (llamado corrientemente guía de imagen) con, a su extremo proximal:

- La fuente que emite continuamente a la longitud de onda de excitación de uno o varios fluoróforos dirigidos, normalmente una fuente láser;

- Medios de barrido rápido en el tiempo del haz de excitación producido por la fuente en líneas y en columnas en un plano XY correspondiente a la sección de entrada de la guía de imagen;

- Medios de inyección del haz de excitación en una de las fibras ópticas;

- Medios de detección de la señal de fluorescencia; y

- Medios de control, particularmente medios de barrido.

Medios que además están previstos para permitir la realización y la visualización de una imagen a partir de las señales detectadas sucesivamente sobre cada fibra.

En el extremo distal de la guía de imagen, se encuentra una cabeza óptica, destinada a ser puesta en contacto con él tejido observado, permitiendo enfocar el haz de excitación a una profundidad determinada (algunas decenas de μm) y entonces realizar una imagen subsuperficial.

En la práctica, este tipo de equipo presenta particularmente las ventajas siguientes:

- Por el lado distal de la guía de imagen se encuentra únicamente una óptica de focalización, que es menos frágil y costosa que una cabeza óptica que integra medios de barrido, la sustitución de la cabeza óptica que puede ser contemplada independientemente de los medios de barrido; por otro lado la cabeza es miniaturizable, lo que presenta un interés en endoscopia y también, de manera general, para aumentar la precisión de posicionamiento;

- Una guía de imagen hecha de fibras ópticas flexibles, sirve de brazo de acceso a la ubicación que hay que observar, lo que es importante para una aplicación in situ.

En el estado de la técnica, se describen los siguientes procedimientos y los equipos de fluorescencia.

En un artículo aparecido en "Applied Optics", Vol. 38, Núm. 34, Diciembre de 1999, páginas 7133-7144, se presenta un micro-endoscopio confocal utilizando un haz de fibras ópticas flexibles provisto en su extremo distal de una cabeza óptica en miniatura de focalización; está previsto barrer el haz de fibras ópticas en líneas, al comprender el equipo una hendidura de detección así como un detector lineal CCD del tipo de transferencia de cargas. Un equipo de este tipo permite obtener 4 imágenes/seg., lo que es demasiado lento para un procesamiento de imágenes in situ dependiendo de los movimientos del sujeto y del operador. Por otro lado, el hecho de barrer en líneas y no por puntos degrada el carácter confocal y conduce a una imagen peor resuelta.

En un artículo aparecido en "Optics Communications", 188 (2001), páginas 267-273, se presenta el acoplamiento de un microscopio confocal de mesa con barrido láser con un haz de fibras ópticas flexibles provisto en su extremo distal de una cabeza óptica en miniatura. El fin buscado es devolver el microscopio compatible con un endoscopio. La exploración se realiza fibra a fibra pero el microscopio de mesa utilizado es de concepción clásica, concebido para visualizar una muestra fija sin preocuparse por el tiempo necesario a fin de obtener una imagen. Un tiempo de exposición de 2 segundos se adelanta en este artículo, demasiado largo para un procesamiento in situ, en tiempo real.

En el artículo "Development of tiene fiber-optic confocal microendoscope for clinical endoscopy", publicado en Proceedings of SPIE, Vol. 4613, páginas 244-253, 01.05.02, se presenta un microscopio confocal de fluorescencia con un haz de fibras ópticas que es barrido en líneas. El microscopio comprende un detector CCD que opera a una frecuencia de 3 MHz, y permite obtener 8 imágenes por segundo, las imágenes comprenden 512 x 512 píxeles.

La presente invención tiene por objeto proponer un procedimiento y un equipo de procesamiento de imágenes de fluorescencia fibrada de alta resolución, particularmente confocal, del tipo que utiliza una guía de imagen hecha de fibras ópticas barridas una por una por un haz de excitación emitido continuamente, dichos procedimiento y equipo permiten la visualización en tiempo real de una ubicación in vivo in situ, es decir capaz de proporcionar un número suficiente de imágenes punto por punto por segundo sin ser dependiente de movimientos del sujeto y del práctico facultativo para permitir particularmente un examen bastante rápido.

La presente invención también tiene como objeto proponer un procedimiento y un equipo que, de manera general, optimizan la calidad de cada imagen con el fin particularmente de obtener una excelente resolución lateral y axial. El procedimiento según la invención está definido en la reivindicación 1.

La presente invención propone una solución para realizar una imagen in vivo in situ en tiempo real. La invención está basada en el respeto del muestreo de las fibras (según el criterio de Shannon) que permite obtener y reconstruir una imagen punto por punto que corresponde bien a cada fibra. Esto permite no perder información preparando muestras del conjunto de las fibras una por una respetando un número medio mínimo de imágenes por segundo, a saber en la práctica 12 imágenes como mínimo por segundo para un modo máximo de 640 x 640 píxeles. La elección de la frecuencia de detección {banda pasante del detector) en función de esta preparación de muestras mínima permite luego para cada fibra detectar el número más grande y posible de fotones de fluorescencia.

Así, según un modo de realización posible, utilizando una guía de imagen de cerca de 30.000 fibras ópticas flexibles, la frecuencia de preparación de muestras y la banda pasante del sistema de detección (fotodiodo de avalancha o equivalente) se fijan sensiblemente sobre 1,5 MHz, correspondiendo aproximadamente a 12 píxeles por fibra, permitiendo entonces obtener por lo menos las 12 imágenes/seg. en modo máximo de 640 x 640 píxeles.

En la práctica, según un modo de realización ventajoso, que permite un escaneo rápido apropiado de las fibras para obtener una imagen en tiempo real, la desviación del haz se ajusta determinando una frecuencia de resonancia rápida de un espejo resonante "línea" y una frecuencia de resonancia lenta de un espejo galvanométrico "trama".

Según la invención, la duración de detección de un flujo procedente de una fibra está limitada en el tiempo y muy corta para respetar la adquisición de una imagen en tiempo real. Según la invención, se han previsto además medios de optimización para recoger y detectar el máximo de flujo procedente de la muestra durante esta duración de detección limitada, particularmente:

- se utilizan medios ópticos de desviación, de inyección, si llega el caso, de focalización y de detección presentando un grado de acromaticidad que depende...

1. Procedimiento para realizar una imagen confocal de fluorescencia in vivo in situ, el procedimiento utiliza una guía de imagen hecha de varios millares de fibras ópticas y consiste en barrer punto por punto un tejido en un plano subsuperficial, cada punto correspondiente a una señal de excitación emitida por una fuente continua, desviada e inyectada en una de las fibras ópticas de dicho haz luego enfocada a la salida de dicha fibra en dicho plano, cada punto emitiendo de vuelta una señal de fluorescencia recogida por dicha fibra óptica, luego detectada y digital izada para formar un elemento de imagen, el procedimiento comporta las siguientes etapas:

- se desvía la señal de excitación a una velocidad que corresponde a la adquisición de un mínimo de 12 imágenes por segundo en el caso de un modo de visualización máxima de 640 x 640 píxeles,

- se detecta la señal de fluorescencia a una frecuencia de detección superior o igual a una frecuencia mínima de preparación de muestreo de las fibras una por una que es sensiblemente igual a 1,5 MHz para dicho mínimo de 12 imágenes por segundo en el caso de un modo de visualización de 640 x 640 píxeles.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por una abertura numérica de la óptica de focalización comprendida sensiblemente entre 0,5 y 1.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que se ajusta una velocidad de desviación del haz de excitación determinando una frecuencia de resonancia rápida de un espejo línea resonante y una frecuencia de resonancia lenta de un espejo trama galvanométrico.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que se utilizan medios ópticos de desviación, de inyección, de focalización y de detección que presentan un grado de acromaticidad que permite recoger fotones sobre toda la anchura de la banda de emisión del fluoróforo excitado.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por una eficacia cuántica de la detección en las longitudes de ondas de fluorescencia que hay que detectar de al menos el 50%.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por una etapa previa de detección del emplazamiento de las fibras de la guía de imagen destinadas a ser utilizadas.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por una etapa previa de determinación del índice real de inyección propio de cada fibra.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por una etapa previa de determinación del flujo recogido correspondiente a la imagen de fondo.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 7 y 8, caracterizado por una etapa de corrección de la señal digital izada procedente de una fibra por sustracción del flujo correspondiente a la imagen de fondo y adaptación al índice real de inyección propio de dicha fibra.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por una etapa de reconstrucción de la imagen a partir de la señal corregida.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por que la etapa de reconstrucción de imagen comprende un filtrado gaussiano de paso bajo.

12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por que la señal de excitación está adaptada a un fluoróforo de tipo endógeno del tejido celular,

13. Equipo de procesamiento de imágenes de fluorescencia confocal fibrada in vivo in situ para la puesta en aplicación del procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

- una guía de imagen (6) que comprende varios millares de fibras ópticas;

- una fuente (1) que emite continuamente en la longitud de onda de excitación por lo menos de un fluoróforo dirigido,

- medios de barrido (4) y de inyección (5) fibra por fibra en el tiempo del haz de excitación producido por la fuente (1) en líneas y en columnas en un plano XY correspondiente a la sección de entrada de la guía de imagen (6);

- medios de separación (3) de la longitud de onda de excitación y de las longitudes de onda de fluorescencia;

- medios de detección (11) de la señal de fluorescencia; y

- medios de tratamiento (12) de la señal detectada permitiendo la realización de una imagen;

en el extremo distal está colocada una cabeza óptica (7), destinada a ser puesta en contacto con el tejido observado (13), que permite enfocar el haz de excitación, los medios de exploración están adaptados a desplazar el haz de excitación a una velocidad que corresponde a la obtención de un mínimo de 12 imágenes por segundo en el caso de un modo de visualización máxima de 640 x 640 píxeles; y

los medios de detección presentan una banda pasante cuya frecuencia es superior o igual a una frecuencia mínima de preparación de muestreo de las fibras una por una que es igual a 1,5 MHz para dicho mínimo de 12 imágenes por segundo en el caso de un modo de visualización de 640 x 640 píxeles.

14. Equipo según la reivindicación 13, caracterizado por que el haz de excitación producido por la fuente (1) es monomodo longitudinal que presenta una calidad de frente de onda óptima para la inyección en una fibra óptica débilmente multimodo.

15. Equipo según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado por que la sección de una fibra es circular, el haz de excitación producido por la fuente es circular para optimizar la inyección en una fibra.

16. Equipo según una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado por medios de configuración (2) del haz utilizados en la salida de la fuente (1) para configurar el haz de excitación con el fin de adaptarlo a los medios de inyección (5) en la guía de imagen (6).

17. Equipo según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado por que los medios para separar las longitudes de onda de excitación y de fluorescencia comprenden un filtro dicroico (3) que tiene un máximo de eficacia en la longitud de onda de excitación.

18. Equipo según una de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizado por medios de rechazo (8) colocados previamente a los medios de detección (11) y adaptados para eliminar la longitud de onda de excitación.

19. Equipo según una de las reivindicaciones 13 a 18, caracterizado por que los medios de exploración (4) comprenden un espejo línea resonante (M1), un espejo galvanométrico trama (M2), un primer sistema óptico afocal (AF1) de engrandecimiento unitario que permite conjugar ambos espejos y un segundo sistema afocal (AF2) de engrandecimiento unitario que permite conjugar los planos de rotación de ambos espejos con el plano de inyección en una de las fibras.

20. Equipo según una de las reivindicaciones 13 a 19, caracterizado por que los medios ópticos de la cabeza óptica (7), los medios de barrido (4), los medios de inyección (5) y los medios de detección presentan un grado de acromatización que permite recoger fotones sobre toda la anchura de la banda espectral de la señal de fluorescencia.

21. Equipo según una de las reivindicaciones 13 a 20, caracterizado por que los medios de inyección (5) comprenden dos conjuntos ópticos (E1, E2), el primer conjunto (E1) está adaptado para corregir las aberraciones ópticas en reborde de campo de los medios de barrido (4) y el segundo conjunto (E2) está adaptado para realizar la inyección propiamente dicha en una de las fibras de la guía de imagen (6).

22. Equipo según la reivindicación 21, caracterizado por que el primer conjunto óptico (E1) comprende un doblete y el segundo conjunto óptico (E2) comprende dos dobletes seguido de una lente.

23. Equipo según una de las reivindicaciones 13 a 22, caracterizado por un orificio de filtración (10) colocado antes de los medios de detección (11) cuyo diámetro se escoge para que la imagen de una fibra se inscriba en él.

24. Equipo según la reivindicación 23, caracterizado por medios de focalización (9) de la señal de fluorescencia sobre el orificio de filtración (10).

25. Equipo según una de las reivindicaciones 13 a 24, caracterizado por que la fuente está adaptada para excitar un fluoróforo endógeno presente en el tejido celular.