Sistema de detección de actividad biológica en tiempo real basado en cromatografía líquida que se caracteriza por la utilización de:

a) un tampón fisiológico como fase móvil, b) una bomba de fluido, c) un inyector, d) una columna compatible con el pH y la composición salina del tampón, e) un transductor, f) una o varias preparaciones de órganos o tejidos (que actuarán como detectores o sensores biológicos) y g) un sistema de medición. El equipo se acompaña de otros elementos como los sistemas de termostatización.

El sistema propuesto permite separar y analizar una muestra hidrosoluble compleja a tiempo real y discriminar si alguno de los productos emanados de la columna posee actividad biológica. Si resultase de interés, el esfuerzo de identificación/purificación se restringiría a esa fracción.

Sistema de detección de actividad biológica en tiempo real basado en cromatografía líquida.

Sector de la técnica

Biotecnología, investigación farmacéutica.

Introducción

La cromatografía líquida es una técnica de separación y cuantificación que utiliza un líquido como vehículo para hacer pasar la muestra a analizar a través de una columna de separación. La columna está rellena de una arena formada por partículas microscópicas que retienen, con diferente afinidad, los componentes de la muestra a analizar. De esta forma las distintas sustancias irán emergiendo de la columna a diferentes tiempos, característicos de cada soluto (tiempo de retención) . Generalmente se coloca un detector “en línea” con la columna para ir identificando y cuantificando los distintos componentes. El sistema ideal sería aquel que permitiese separar y detectar todos los componentes en un espacio de tiempo razonable.

Dos son las modalidades principales de cromatografía líquida:

a) Cromatografía líquida de alta presión HPLC. Donde se utilizan pequeñas columnas de relleno altamente compactado para las que se requiere altas presiones. El volumen de muestra que podemos analizar es bajo, habitualmente menor de 100 μL.

b) Cromatografía de baja o media presión (FPLC ó MPLC) . Utiliza columnas de medio o gran tamaño. Generalmente no requieren grandes presiones para hacer pasar flujos moderados de líquido (4-10 mL/min) a su través. Pueden hacerse inyecciones de muestra de varios mL.

Al líquido utilizado para acarrear las muestras se le denomina fase móvil. Por el contrario al relleno de la columna se le denomina fase estacionaria. Hasta hace bien poco los rellenos de las columnas de HPLC sólo admitían fases móviles con pH muy ácidos y con altos contenidos en disolventes no-polares (metanol, acetonitrilo) . Con la llegada de nuevos rellenos para columnas ya es posible utilizar tampones fisiológicos (de composición similar al medio extracelular normal) como fases móviles, por lo que no es preciso añadir disolventes y se puede trabajar al pH fisiológico.

Estado de la técnica

Uno de los problemas derivados tanto de la síntesis combinatoria como de la extracción de moléculas desde productos de origen natural reside en la necesidad de aislar y purificar los diferentes compuestos antes de proceder a su análisis farmacológico. Ello supone un descomunal esfuerzo tanto de tiempo como de dinero además de disponer de una cantidad considerable de material inicial, con el fin de obtener suficiente productos de cada una de los sustancias puras. Luego se precisará del cribado farmacológico de cada sustancia una por una.

Por probabilidad, la mayoría o todos los productos aislados resultan poco o nada activos. El sistema propuesto permite separar y analizar una muestra hidrosoluble compleja y discriminar, en tiempo real, si alguno de los productos emanados de la columna posee actividad biológica. Si resultase de interés, el esfuerzo de identificación/purificación se restringiría a esa fracción.

Descripción de la invención

Se trata de utilizar preparaciones biológicas como detectores de actividad farmacológica, en tiempo real, de las sustancias que vayan emergiendo de la columna de separación cromatográfica. Dado que la fase móvil a emplear es un tampón fisiológico, similar al utilizado en las preparaciones clásicas en farmacología podemos mantener saludablemente, durante varias horas, una o más preparaciones biológicas cuya actividad (contráctil, secretora, eléctrica) podemos medir.

El sistema se caracteriza por la utilización de (véase Figura 1) : a) un tampón fisiológico como fase móvil, b) una bomba de fluido, c) un inyector, d) una columna compatible con el pH y la composición salina del tampón, e) un transductor, f) una o varias preparaciones de órganos o tejidos (que actuarán como detectores o sensores biológicos) y g) un sistema de medición. El equipo se acompaña de otros elementos como los sistemas de termostatización.

La invención se puede aplicar con dos técnicas de cromatografía:

- HPLC de utilidad para muestras muy concentradas o de uso con preparaciones biológicas de poco volumen (células en cultivo, órganos pequeños) . Requiere de algunas modificaciones en el sistema de bombeo a fin de oxigenar el tejido.

- MPLC al admitir grandes volúmenes de inyección resulta de utilidad para muestras menos concentradas y permite el uso en preparaciones de cierto tamaño. La figura 3 muestra un registro obtenido con este sistema.

Como preparación de los detectores o sensores biológicos (f) puede utilizarse, en principio, cualquier órgano, tejido o célula aislada (o su combinación) cuya acción pueda ser medida, tales como: el conducto deferente, útero, intestino, arteria aorta, vena porta, aurícula aislada, corazón o riñón aislados de diversos animales, etc., que pueden colocarse individualmente o en serie a fin de explorar la acción de las sustancias emergentes sobre diferentes receptores farmacológicos, canales, enzimas, etc ...

Descripción de las figuras

Figura 1: Descripción general del sistema siendo: a) un tampón fisiológico como fase móvil, b) una bomba de fluido, c) un inyector, d) una columna compatible con el pH y la composición salina del tampón, e) un transductor, f) una o varias preparaciones de órganos o tejidos (que actuarán como detectores) y g) un sistema de medición. El equipo se acompaña de otros elementos como los sistemas de termostatización.

Figura 2: Sistema para HPLC adaptado a riñón prefundido de rata.

Figura 3: Registros obtenidos en el sistema HPLC adaptado a riñón prefundido de rata. El trazo del primer pico (≈18 minutos) es una solución estándard de fenilefrina 1 μM. El trazo que se corresponde con la elución a los 23 minutos se obtuvo tras inyectar 1 mL de un extracto hidrosoluble de origen vegetal. La escala en ordenadas muestra los incrementos sobre la basal (80 mmHg) de la presión de perfusión de un riñón de rata. En abscisas se muestran los tiempos de retención en una columna XK16 (Pharmacia) rellena con Sephadex 100.

Figura 4: Diseño del sistema para HPLC adaptado a varias preparaciones.

Figura 5: Registro en cascada de dos preparaciones. Se colocaron en serie un conducto deferente y un anillo de aorta de rata. Las contracciones isométricas son mostradas. La de mayor pico corresponde a la respuesta del conducto deferente y a la de menor pico a la arteria aorta. La escala en ordenadas indica la contracción (1 V= 500 mg) . En abscisas se muestra el tiempo de retención.

Modos de realización de la invención

Ejemplo 1

Sistema para HPLC adaptado a riñón perfundido de rata. (Figura 2)

Mediante el burbujeo continuo con helio (1) el tampón fisiológico (Solución de Krebs-HEPES) es desgasificado.

(2) Una bomba de HPLC (3) envía la solución con un flujo constante de 1-2 mL/min hacia un inyector de asa manual

o automático (4) y de ahí a una columna de fase reversa con relleno compatible con pH 7, 4 (C18, 5 μm partícula) , (5) . Desde un reservorio con una solución de Krebs-HEPES burbujeado con oxígeno (6) y la ayuda de una bomba de fluidos

(8) el efluente de la columna (que llega desgasificado) se mezcla al 50% (9) . Un inyector manual situado en línea (10) permite el calibrado de la preparación con concentraciones conocidas de fármacos (por ejemplo noradrenalina) . La mezcla se atempera a 37ºC (11) y se dirige a un riñón de rata perfundido a través de su arteria renal (13) . La presión de infusión se monitoriza continuamente mediante un transductor (12) . El sistema tiene incorporado un sistema de derivación a fin de evitar el paso por la preparación de aquellas partes del efluente que pudiesen dañar a la preparación (7) .

En la Figura 3 se muestran los resultados obtenidos en la experiencia. La imagen muestra dos registros superpuestos. El trazo del primer pico (≈18 minutos) es una solución estándard de fenilefrina 1 μM. La fenilefrina es un estimulante de los receptores alfa-1 adrenérgicos. El trazo que se corresponde con la elución a los 23 minutos se obtuvo tras inyectar 1 mL de un extracto hidrosoluble...

1. Sistema de detección de actividad biológica en tiempo real basado en cromatografía líquida que comprende: a) un tampón fisiológico como fase móvil, b) una bomba de fluido, c) un inyector, d) una columna compatible con el pH y la composición salina del tampón, e) un transductor, f) una o varias preparaciones de órganos o tejidos (que actuarán como detectores) g) un sistema de medición y h) sistemas de termostatización.

2. Sistema de detección de actividad biológica en tiempo real basado en cromatografía líquida según reivindicación 1, caracterizado por la utilización de sistemas de termostatización.

3. Procedimiento de detección de actividad biológica en tiempo real basado en cromatografía líquida caracterizado por las siguientes etapas:

Etapa 1: Mediante el uso de un sistema de degasificación (1) en la fase móvil (2) , una bomba (3) envía una solución con un flujo constante hacia un inyector (4) y de ahí a una columna (5) .

Etapa 2: Desde un reservorio con una solución (6) y la ayuda de una bomba de fluidos (8) el efluente de la columna se mezcla en la proporción adecuada (9) .

Etapa 3: Se calibra la preparación con concentraciones de fármacos conocidas o sustancias a identificar en un inyector situado en línea (10) .

Etapa 4: La mezcla se atempera a una temperatura adecuada a la preparación farmacológica utilizada (11) y se dirige al detector/sensor biológico (13) .

Etapa 5: La presión de infusión se monitoriza continuamente mediante un transductor (12) . Se evita el paso por la preparación de aquellas partes del efluente que pudiesen dañar a la preparación (7) , mediante un sistema de derivación incorporado.