SELECCIÓN DE PROTEÍNAS USANDO FUSIONES DE ARN-PROTEÍNA.

Actualmente existen procedimientos para el aislamiento de moléculas de ARN y ADN basándose en sus funciones. Por ejemplo, los experimentos de Ellington y Szostak (Nature 346: 818 (1990); y Nature 355: 850 (1992)) y Tuerk y Gold (Science 249: 505 (1990); y J. Mol. Biol 222: 739 (1991)) han demostrado que pueden aislarse moléculas de ácido nucleico muy poco frecuentes (es decir, menos de 1 en 10 13 ) con propiedades deseadas de combinaciones complejas de moléculas por rondas repetidas de selección y amplificación. Estos procedimientos ofrecen ventajas sobre las selecciones genéticas tradicionales en el sentido de que (i) pueden explorarse combinaciones de candidatos muy grandes (>10 15 ), (ii) la viabilidad del huésped y las condiciones in vivo no suponen una preocupación y (iii) las selecciones pueden llevarse a cabo incluso si no existe una exploración genética in vivo. La potencia de la selección in vitro se ha demostrado en la definición de nuevas secuencias de ARN y ADN con funciones de unión a proteínas muy específicas (véase, por ejemplo, Tuerk y Gold, Science 249: 505 (1990); Irvine y col., J. Mol. Biol 222: 739 (1991); Oliphant y col., Mol. Cell Biol. 9: 2944 (1989); Blackwell y col., Science 250: 1104 (1990); Pollock y Treisman, Nuc. Acids Res. 18: 6197 (1990); Thiesen y Bach, Nuc. Acids Res. 18: 3203 (1990); Bartel y col., Cell 57: 529 (1991); Stormo y Yoshioka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5699 (1991); y Bock y col., Nature 355: 564 (1992)), funciones de unión a moléculas pequeñas (Ellington y Szostak, Nature 346: 818 (1990); Ellington y Szostak, Nature 355: 850 (1992)) y funciones catalíticas (Green y col., Nature 347: 406 (1990); Robertson y Joyce, Nature 344: 467 (1990); Beaudry y Joyce, Science 257: 635 (1992); Bartel y Szostak, Science 261: 1411 (1993); Lorsch y Szostak, Nature 371: 31-36 (1994); Cuenoud y Szostak, Nature 375: 611-614 (1995); Chapman y Szostak, Chemistry and Biology 2: 325-333 (1995); y Lohse y Szostak, Nature 381: 442-444 (1996)). No se ha demostrado un esquema similar para la selección y amplificación de proteínas. Se asume que una molécula de tipo virus que comprende un cofactor específico de una ribozima de replicación unida a su ARN genético ha sido un mediador en la coevolución de la replicación y la traducción. Esta molécula también se ha descrito como útil para la modificación por ingeniería genética molecular evolutiva usando el sistema de traducción sin células (Husimi y col., Progress in biophysics and molecular biology 65, supl.1, página 64, 1996). Niemeyer y col. (Nucleic Acids Research 22(25): 5530-5539, 1994) describen moléculas híbridas en las que un ADN monocatenario corto se entrecruza con estreptavidina. Por lo tanto, estas moléculas híbridas semisintéticas comprenden un dominio de unión específico para ácidos nucleicos complementarios, así como los cuatro sitios de unión a biotina nativos de la estreptavidina. Esta bioespecificidad permite que las moléculas híbridas atraigan ácidos nucleicos complementarios y proteínas biotiniladas hacia un complejo y por lo tanto sirvan como conectores para la generación de bioconjugados supramoleculares y matrices macroscópicas. Sumario de la invención La invención se refiere a una microplaca que comprende una matriz de ácidos nucleicos monocatenarios inmovilizados, estando dichos ácidos nucleicos hibridados con fusiones de ARN-proteína, en la que cada una de dichas fusiones de ARN-proteína comprende un ARN unido covalentemente en el extremo 3 del ARN a una proteína a través de un aceptor peptídico, y en la que dicha proteína está codificada por dicho ARN. La invención también se refiere a una biblioteca de moléculas, comprendiendo cada una un ácido ribonucleico unido covalentemente a una proteína codificada por dicho ácido ribonucleico. La invención también se refiere a una molécula que comprende una porción de ácido ribonucleico (ARN) y a una porción de proteína codificada por dicha porción de ácido ribonucleico; en la que la porción de ácido ribonucleico está unida covalentemente a dicha porción de proteína a través de un aceptor peptídico, y en la que la porción de ácido ribonucleico está unida covalentemente en su extremo 3 a dicho aceptor peptídico a través de un sitio de pausa. La invención también se refiere a una molécula que comprende un ácido ribonucleico unido covalentemente a un anticuerpo, en la que dicho anticuerpo está codificado en su totalidad por dicho ácido ribonucleico. La invención también se refiere a un ácido ribonucleico que comprende una secuencia de inicio de la traducción y un codón de inicio unido operativamente a una secuencia codificante de proteína candidata, estando dicho ácido ribonucleico unido covalentemente a un aceptor peptídico en el extremo 3 de dicha secuencia codificante de proteína candidata, que comprende además una secuencia de ADN o análogo de ADN unida covalentemente al extremo 3 del ácido ribonucleico. El propósito de la presente invención es permitir que los principios de la selección in vitro y de la evolución in vitro se apliquen a proteínas. La invención facilita el aislamiento de proteínas con propiedades deseadas a partir de grandes combinaciones de secuencias de aminoácidos parcialmente o totalmente aleatorias. Además, la invención resuelve el problema de recuperar y amplificar la información de secuencia proteica uniendo covalentemente la secuencia codificante de ARNm a la molécula de proteína. En general, el método de la invención consiste en un protocolo de transcripción/traducción in vitro o in situ que 2   genera una proteína unida covalentemente al extremo 3 de su propio ARNm, es decir, una fusión de ARN-proteína. Esto se logra por síntesis y traducción in vitro o in situ de una molécula de ARNm con un aceptor peptídico unido a su extremo 3. Un aceptor peptídico preferido es puromicina, un análogo nucleosídico que se añade al extremo Cterminal de una cadena peptídica en crecimiento y termina la traducción. En un diseño preferido, se incluye una secuencia de ADN entre el extremo del mensaje y el aceptor peptídico que está diseñado para provocar que el ribosoma se detenga en el extremo de la fase de lectura abierta, proporcionando un tiempo adicional para que el aceptor peptídico (por ejemplo, puromicina) acepte la cadena peptídica naciente antes de la hidrólisis del enlace de peptidil-ARNt. Si se desea, la fusión de ARN-proteína resultante permite rondas repetidas de selección y amplificación porque la información de secuencia proteica puede recuperarse por transcripción inversa y amplificación (por ejemplo, mediante amplificación por PCR, así como cualquier otra técnica de amplificación, incluyendo técnicas de amplificación basadas en ARN, tales como 3SR o TSA). Después, el ácido nucleico amplificado puede transcribirse, modificarse y traducirse in vitro o in situ para generar fusiones de ARNm-proteína para la siguiente ronda de selección. La capacidad para llevar a cabo múltiples rondas de selección y amplificación permite el enriquecimiento y aislamiento de moléculas muy poco frecuentes, por ejemplo, una molécula deseada de una combinación de 10 15 miembros. Esto a su vez permite el aislamiento de proteínas nuevas o mejoradas que reconozcan específicamente prácticamente cualquier diana o que catalicen reacciones químicas deseadas. Por consiguiente, una proteína deseada puede seleccionarse por un procedimiento que implique las etapas de: (a) proporcionar una población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales incluye una secuencia de inicio de la traducción y un codón de inicio unido operativamente a una secuencia codificante de proteína candidata, y cada una de las cuales está unida operativamente a un aceptor peptídico en el extremo 3 de la secuencia codificante de proteína candidata; (b) traducir in vitro o in situ las secuencias codificantes de proteínas candidatas para producir una población de fusiones de ARN-proteína candidatas; y (c) seleccionar una fusión de ARN-proteína deseada, seleccionando de este modo la proteína deseada. Una molécula de ADN que codifica una proteína deseada puede seleccionarse mediante un procedimiento que implique las etapas de: (a) proporcionar una población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales incluye una secuencia de inicio de la traducción y un codón de inicio unido operativamente a una secuencia codificante de proteína candidata, y cada una de las cuales está unida operativamente a un aceptor peptídico en el extremo 3 de la secuencia codificante de proteína candidata; (b) traducir in vitro o in situ las secuencias codificantes de proteínas candidatas para producir una población de fusiones de ARN-proteína candidatas; (c) seleccionar una fusión de ARN-proteína deseada; y (d) generar a partir de la porción... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones para los Estados Contratantes siguientes: AT, BE, CH, DK, ES, FR, GB, IT, LI, LU, MC, NL, SE, 1. Una microplaca que comprende una matriz de ácidos nucleicos monocatenarios inmovilizados, estando dichos ácidos nucleicos hibridados con fusiones de ARN-proteína, en la que cada una de dichas fusiones de ARN-proteína comprende un ARN unido covalentemente en el extremo 3 del ARN a una proteína a través de un aceptor peptídico, y en la que dicha proteína está codificada por dicho ARN. 2. La microplaca de la reivindicación 1, en la que dicho ARN está unido covalentemente a dicho aceptor peptídico a través de un sitio de pausa. 3. La microplaca de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho aceptor peptídico se selecciona de puromicina, conjugado de ARNt-puromicina, fenilalanina-adenosina, tirosil adenosina, alanil adenosina, fenilalanil 3 desoxi 3 amino adenosina, alanil 3 desoxi 3 amino adenosina y tirosil 3 desoxi 3 amino adenosina, y en la que dicha proteína está codificada por dicho ARN unido covalentemente. 4. Una biblioteca de moléculas comprendiendo cada una un ácido ribonucleico unido covalentemente a una proteína codificada por dicho ácido ribonucleico. 5. La biblioteca de la reivindicación 4, en la que dicho ácido ribonucleico está unido covalentemente en el extremo 3 a dicha proteína a través de un aceptor peptídico. 6. La biblioteca de la reivindicación 5, en la que dicho aceptor peptídico es puromicina. 7. La biblioteca de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en la que dicho ácido ribonucleico está unido covalentemente a dicho aceptor peptídico a través de un sitio de pausa. 8. La biblioteca de una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en la que dicha biblioteca comprende al menos 10 9 moléculas diferentes. 9. Una molécula que comprende una porción de ácido ribonucleico (ARN) y una porción de proteína codificada por dicha porción de ácido ribonucleico; en la que la porción de ácido ribonucleico se une covalentemente a dicha porción de proteína a través de un aceptor peptídico, y en la que la porción de ácido ribonucleico se une covalentemente en su extremo 3 a dicho aceptor peptídico a través de un sitio de pausa. 10. La molécula de la reivindicación 9, en la que el sitio de pausa es ácido desoxirribonucleico. 11. La molécula de la reivindicación 10, en la que el ácido desoxirribonucleico comprende una secuencia de oligo dA. 12. La molécula de la reivindicación 9, en la que el sitio de pausa es una combinación de ácido desoxirribonucleico y un resto no nucleotídico. 13. La molécula de la reivindicación 12, en la que el resto no nucleotídico comprende uno o más restos HO(CH2CH2O)3PO2. 14. La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en la que el aceptor peptídico es puromicina. 15. Una molécula que comprende un ácido ribonucleico unido covalentemente a un anticuerpo, en la que dicho anticuerpo está totalmente codificado por dicho ácido ribonucleico. 16. La molécula de la reivindicación 15, en la que dicho anticuerpo se selecciona en el grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo de cadena sencilla. 17. La molécula de la reivindicación 15 ó 16, que comprende además un efector peptídico situado entre dicho ácido ribonucleico y dicho anticuerpo. 18. La molécula de una cualquiera de las reivindicaciones 9-17, en la que dicha molécula está inmovilizada en un soporte sólido. 19. La molécula de la reivindicación 18, en la que dicho soporte sólido es una microplaca. 20. Un ácido ribonucleico que comprende una secuencia de inicio de la traducción y un codón de inicio unido operativamente a una secuencia codificante de proteína candidata, estando dicho ácido ribonucleico unido covalentemente a un aceptor peptídico en el extremo 3 de dicha secuencia codificante de proteína candidata, que comprende además una secuencia de ADN o análogo de ADN unida covalentemente al extremo 3 del ácido ribonucleico. 32   21. El ácido ribonucleico de la reivindicación 20, en el que el aceptor peptídico es puromicina. 33   34   FIG. 2   36   37   38   39     41   42   43   44     46   47   48   49