REGULACIÓN MEDIADA POR ARNBC DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN PLANTAS.

Regulación mediada por ARNbc de la expresión génica en plantas La presente invención se refiere a procedimientos para alterar la expresión de genes en plantas, en particular usando fragmentos de ARN sentido y antisentido de dichos genes y a plantas con expresión génica alterada obtenidas usando los procedimientos de la presente invención. Los desarrollos en las técnicas de biología molecular y transformación de plantas han permitido la producción de plantas transgénicas con diversos rasgos deseables, tales como, por ejemplo, resistencia a insectos y patógenos fúngicos o microbianos, tolerancia a herbicidas o rasgos de valor añadido. Estos rasgos deseables se obtienen principalmente mediante sobreexpresión de un transgén en la planta. Sin embargo, en algunos casos, también es deseable modificar plantas de modo que la expresión de un gen particular se altere para crear plantas con fenotipos deseables o propiedades de interés comercial. Los procedimientos actuales para alterar la expresión de un gen habitualmente se basan en técnicas de supresión sentido o antisentido. Por ejemplo, la supresión sentido de un gen de chalcona sintasa en Petunia da como resultado flores con pigmentación alterada y la supresión antisentido de un gen de poligalacturonidasa en tomate conduce a retardo en la maduración de la fruta. Desafortunadamente, estos procedimientos son con frecuencia variables e impredecibles en su capacidad para alterar la expresión génica y en muchos casos no se consigue una interrupción completa de actividad génica particular. Otros procedimientos para alterar la expresión génica incluyen el uso de ribonucleótidos catalíticos o ribozimas, que puede ser técnicamente difícil o interrupción génica homóloga, que, aunque es la más deseable genéticamente, desafortunadamente no es suficientemente eficaz con las técnicas disponibles en la actualidad para usarse rutinariamente para tales fines. Existe por lo tanto una necesidad largamente sentida pero no satisfecha de nuevos procedimientos que permitan alterar de forma eficaz y predecible la expresión de un gen en células vegetales para obtener plantas con propiedades mejoradas y comercialmente importantes. El documento EP0458367A1 describe estudios de prueba de concepto de supresión génica mediada por antisentido. Específicamente, el gen aroA de la bacteria Salmonella typhimurium se usó como el gen exógeno diana expresado en plantas. La reducción de la expresión del gen exógeno diana aroA se demostró después de la expresión de la secuencia diana como un ARN diana sentido positivo (ARN sentido), que se neutralizó después por el ARN sentido negativo correspondiente (secuencia de aroA antisentido). Fire, A. y col (Nature, 1998, Vol. 391, pág. 806-811) describe expresión reducida de un gen diana en gusanos nematodos después de microinyección de un ARN bicatenario correspondiente al gen diana. La especie de ARN se preparó in vitro antes de la inyección en el gusano. Wassenegger, M. y Pelissier, T. (Plant Molecular Biology, 1998, Vol. 37, pág. 349-362) describe diversas teorías de supresión génica en plantas. En particular se propone un mecanismo unificado que explica las observaciones de supresión génica anteriores. En el mecanismo unificado, una ARN polimerasa dependiente de ARN crea especies de ARN antisentido cortas de un molde de ARN sentido. Estas especies de ARN antisentido median después la supresión del gen diana. Los documentos tanto WO 99/32619 como WO 99/49029 son relevantes para los fines de novedad solamente según el artículo 54 (3) de EPC. El documento WO 99/32619 describe expresión reducida de un gen diana usando ARN bicatenario diseñado específicamente correspondiente al gen diana. El documento WO 99/49029 describe un procedimiento para modular la expresión de un gen diana usando una o más moléculas de ácido nucleico dispersadas o moléculas de ácido nucleico ajenas que se introducen en una célula, tejido u órgano. Las moléculas introducidas comprenden múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana o una región del mismo durante un tiempo y en condiciones suficientes para que la traducción del producto de ARNm de dicho gen diana se modifique. Como alternativa, las múltiples copias son complementarias en secuencia a la secuencia de nucleótidos del gen diana. Los procedimientos están sujetos a la condición de que la transcripción de dicho producto de ARNm no se reprima o reduzca de forma exclusiva. La presente invención se refiere a la producción de plantas con propiedades y rasgos mejorados usando técnicas moleculares y transformación genética. En particular, la invención se refiere a procedimientos para alterar la expresión de un gen en una célula vegetal usando fragmentos de ARN sentido y antisentido del gen. Resulta importante que dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido son capaces de formar una molécula de ARN bicatenaria. La invención también se refiere a células vegetales obtenidas usando tales procedimientos, a plantas derivadas de tales células, a la descendencia de tales plantas y a semillas derivadas de tales plantas. En tales células vegetales o plantas, la alteración de la expresión génica de un gen particular es más eficaz, selectiva y más predecible que la alteración de la expresión génica de un gen particular obtenido usando procedimientos actuales conocidos en la técnica. 2   La invención se refiere por lo tanto a: Un procedimiento que comprende introducir en una célula vegetal un fragmento de ARN sentido de un gen diana y un fragmento de ARN antisentido de dicho gen diana, en el que dicho fragmento de ARN sentido y dicho fragmento de ARN antisentido son capaces de formar una molécula de ARN bicatenaria, en la que la expresión de dicho gen diana en dicha célula está alterada. En particular, la invención proporciona un procedimiento para reducir la expresión de un gen diana en una célula vegetal que comprende introducir en la célula vegetal una primera secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN sentido de un gen diana y una segunda secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN antisentido de dicho gen diana, en el que dichas primera y segunda secuencias de ADN están comprendidas en una molécula de ADN, en el que dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido son capaces de formar una molécula de ARN bicatenaria, en el que dicha molécula de ADN comprende además una secuencia de ADN que comprende un engarce que comprende señales de procesamiento de intrones entre dicha primera y segunda secuencias de ADN, en el que la expresión de dicho gen diana en dicha célula vegetal se reduce cuando dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido se expresan de dichas primera y segunda secuencias de ADN y dichos fragmentos de ARN forman una molécula de ARN bicatenaria. En consecuencia la invención se refiere a: Un procedimiento que comprende introducir en una célula vegetal una primera secuencia de ADN capaz de expresar en dicha célula un fragmento de ARN sentido de un gen diana y una segunda secuencia de ADN capaz de expresar en dicha célula un fragmento de ARN antisentido de dicho gen diana, en el que dicho fragmento de ARN sentido y dicho fragmento de ARN antisentido son capaces de formar una molécula de ARN bicatenaria; en el que la expresión de dicho gen diana en dicha célula vegetal está alterada. Las secuencias de ADN están comprendidas en una molécula de ADN que está integrada de forma estable preferentemente en el genoma de la célula vegetal. La molécula de ADN comprende adicionalmente preferentemente un promotor ligado operativamente a dicha primera o dicha segunda secuencia de ADN. Como se ha observado anteriormente, la primera secuencia de ADN y la segunda secuencia de ADN están comprendidas en una molécula de ADN. La primera secuencia de ADN y la segunda secuencia de ADN están comprendidas preferentemente en la misma cadena de ADN de dicha molécula de ADN y, preferentemente, el fragmento de ARN sentido y el fragmento de ARN antisentido están comprendidos en una molécula de ARN. La molécula de ARN es capaz de plegarse de modo que dichos fragmentos de ARN comprendidos en la misma forman una región bicatenaria. En otra realización preferida, el fragmento de ARN sentido y el fragmento de ARN antisentido están comprendidos en o se expresan como dos moléculas de ARN. En este caso, la primera secuencia de ADN y la segunda secuencia de ADN están preferentemente ligadas operativamente a un promotor bidireccional o, como alternativa, la primera secuencia de ADN está ligada operativamente a un primer promotor y la segunda secuencia de ADN está ligada operativamente a un segundo promotor, siendo el primer promotor y el segundo promotor el mismo promotor o promotores diferentes. En otra realización preferida,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para reducir la expresión de un gen diana en una célula vegetal que comprende introducir en la célula vegetal una primera secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN sentido de un gen diana y una segunda secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN antisentido de dicho gen diana, en el que dichas primera y segunda secuencias de ADN están comprendidas en una molécula de ADN, en el que dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido son capaces de formar una molécula de ARN bicatenaria, en el que dicha molécula de ADN comprende adicionalmente una secuencia de ADN que comprende un engarce que comprende señales de procesamiento de intrones entre dicha primera y segunda secuencias de ADN, en el que la expresión de dicho gen diana en dicha célula vegetal se reduce cuando dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido se expresan de dichas primera y segunda secuencias de ADN y dichos fragmentos de ARN forman una molécula de ARN bicatenaria. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ADN que comprende dicha primera y dicha segunda secuencias de ADN se introduce en dicha célula vegetal por un vector de transformación de plantas. 3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho vector de transformación de plantas comprende adicionalmente un gen marcador seleccionable, opcionalmente en el que dicho gen marcador seleccionable es EPSPS o DHFR. 4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho gen diana es un gen esencial de dicha célula vegetal. 5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho gen diana es un gen heterólogo, preferentemente integrado de forma estable en el genoma de dicha célula vegetal. 6. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que la molécula de ARN bicatenaria tiene una longitud de 50 nucleótidos o más. 7. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que dichas secuencias de ADN que codifican dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido están ligados operativamente a un promotor, preferentemente en el que dicho promotor es el promotor nativo de un gen diana nativo, un promotor heterólogo, un promotor constitutivo, un promotor inducible, por ejemplo, un promotor inducible por lesión, un promotor específico de tejido o un promotor regulado por el desarrollo. 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicha molécula de ADN que comprende dicha primera y dicha segunda secuencias de ADN se integra de forma estable en el genoma de la célula vegetal. 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada adicionalmente por las características de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7. 10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 en el que dicha molécula de ADN que comprende dicha primera y dicha segunda secuencias de ADN se integra de forma estable en el genoma de la célula vegetal y en el que dicho gen marcador seleccionable se integra también de forma estable en el genoma de la célula vegetal. 11. Una célula vegetal que comprende una primera secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN sentido de un gen diana y una segunda secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN antisentido de dicho gen diana, siendo dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido capaces de formar una molécula de ARN bicatenaria, estando comprendidas dicha primera y segundas secuencias de ADN en una molécula de ADN, que se integra de forma estable en el genoma de dicha célula vegetal, comprendiendo dicha célula vegetal además una secuencia de ADN que comprende un engarce que comprende señales de procesamiento de intrones entre dicha primera secuencia de ADN y dicha segunda secuencia de ADN, reduciéndose la expresión de dicho gen diana en dicha célula vegetal cuando dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido se expresan de dicha primera y segunda secuencias de ADN y dichos fragmentos de ARN forman una molécula de ARN bicatenaria. 12. Una célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicha célula vegetal comprende adicionalmente un gen marcador seleccionable que se integra de forma estable en el genoma de dicha célula vegetal, opcionalmente siendo dicho gen marcador seleccionable DHFR o EPSPS. 13. Una célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 11 o reivindicación 12, caracterizada adicionalmente por las características de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7. 14. Una planta que comprende una célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 12 o reivindicación 13; o la descendencia de dicha planta comprendiendo dicha descendencia una célula vegetal de acuerdo con las reivindicaciones 12 ó 13. 15. Una semilla que comprende una célula vegetal de acuerdo con la reivindicación 12 o reivindicación 13. 26   16. Un vector de transformación de plantas para su uso en la reducción de la expresión de un gen diana en una célula vegetal, comprendiendo dicha transformación de plantas una primera secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN sentido de un gen diana y una segunda secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN antisentido de dicho gen diana, siendo capaces dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido de formar una molécula de ARN bicatenaria, comprendiendo dicho vector de transformación de plantas adicionalmente una secuencia de ADN que comprende un engarce que comprende señales de procesamiento de intrones entre dicha primera secuencia de ADN que codifica dicho fragmento de ARN sentido y dicha segunda secuencia de ADN que codifica dicho fragmento de ARN antisentido. 17. El vector de transformación de plantas de la reivindicación 16 que comprende adicionalmente un gen marcador seleccionable, opcionalmente siendo dicho marcador seleccionable EPSPS o DHFR. 18. El vector de transformación de plantas de la reivindicación 16 o reivindicación 17, caracterizado adicionalmente por las características de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7. 19. El uso de un vector de transformación de plantas de cualquiera de las reivindicaciones 16, 17 ó 18 en la reducción de la expresión de un gen diana en una célula vegetal; en el que la expresión de dicho gen diana en dicha célula vegetal se reduce cuando dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido se expresan de dichas primera y segunda secuencias de ADN y dichos fragmentos de ARN forman una molécula de ARN bicatenaria. 20. Un procedimiento para producir una planta transformada genéticamente que comprende las etapas de: i) introducir en una célula vegetal una primera secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN sentido de un gen diana y una segunda secuencia de ADN capaz de expresar un fragmento de ARN antisentido de dicho gen diana, estando comprendidas dicha primera y segunda secuencias de ADN en una molécula de ADN, siendo capaces dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido de formar una molécula de ARN bicatenaria, comprendiendo dicha molécula de ADN un engarce que comprende señales de procesamiento de intrones entre ADN que codifican dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido, introduciéndose dicha molécula de ADN que comprende dicha primera y segunda secuencias de ADN en dicha célula vegetal por un vector de transformación de plantas, comprendiendo dicho vector adicionalmente un gen marcador seleccionable, opcionalmente DHFR o EPSPS; y seleccionándose una célula vegetal en la que dicha molécula de ADN y dicho gen marcador seleccionable están integrados de forma estable en el genoma de la célula vegetal y reduciéndose la expresión de dicho gen diana en dicha célula vegetal cuando dichos fragmentos de ARN sentido y antisentido se expresan de dichas primera y segunda secuencias de ADN y dichos fragmentos de ARN forman una molécula de ARN bicatenaria; y ii) regenerar una planta transformada genéticamente que comprende dicha molécula de ADN y dicho gen marcador seleccionable. 21. El procedimiento de la reivindicación 20 caracterizado adicionalmente por las características de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7. 27