Proteína de fusión del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP),

que comprende:

a) un péptido de exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende un dominio de unión y un dominio detranslocación, ubicado en el extremo N-terminal de la proteína de fusión;

b) un péptido de fusión de ORF6-5 2 26 (SEQ ID NO: 11) y ORF5-31-63 (SEQ ID NO: 10) de la cepaamericana de VSRRP, o un péptido de fusión de ORF6-M1-I28 (SEQ ID NO: 12) y ORF5-F31 A64 (SEQ IDNO: 13) de la cepa europea de VSRRP; y

c) un dominio carboxilo-terminal que comprende la secuencia de aminoácidos de KDEL-KDEL-KDELubicada en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en el que las letras mayúsculas "KDEL"representan códigos de aminoácido de una sola letra.

Proteína de fusión del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino como vacuna contra el SRRP

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a una proteína de fusión de la vacuna de subunidades contra el SRRP que induce títulos de neutralización del VSRRP en cerdos.

2. Descripción de la técnica relacionada

El síndrome reproductor y respiratorio porcino es una enfermedad infecciosa porcina que afecta principalmente a las vías respiratorias de los cerdos en diversas edades y da como resultado cerdas que tienen disfunción reproductora. El VSRRP es un virus resistente que no tiende a provocar anticuerpos que tienen títulos de neutralización en el cerdo infectado. Además, el VSRRP es un virus de ARN y se reproduce fácilmente basándose en un sistema genético simplificado, de modo que la probabilidad de mutaciones genéticas es muy alta. Además, las infecciones y la vía patogénica del virus del SRRP pueden clasificarse en dos etapas: (A) infecciones de tejidos epiteliales de los tractos reproductores superior e inferior; y (B) infecciones de monocitos y macrófagos en tejidos que rodean los tractos reproductores. Por tanto, el huésped debe tener inmunidad de fluidos corporales así como inmunidad de la mucosa con títulos de neutralización y también una respuesta inmunitaria mediada por células para facilitar la eliminación de los virus infectados y reforzar los mecanismos de protección del huésped. Sin embargo, no resulta demasiado fácil que el cerdo infectado con VSRRP tenga títulos de neutralización en condiciones naturales, por lo que los anticuerpos típicos básicamente tienen poco efecto sobre el VSRRP, e incluso inducen mutaciones en los virus. Además, en un aumento dependiente de anticuerpo de la fagocitosis, los anticuerpos sólo podrían provocar infecciones por VSRRP más graves.

La patente taiwanesa n.º I-2289933 y la publicación de patente estadounidense n.º US 2004/0247617 dan a conocer una proteína de fusión específica de células diana, que utiliza una resto y un dominio funcional de exotoxinas de Pseudomonas aeruginosa para fusionar un fragmento de proteína nuclear ORF7 del VSRRP, con un péptido señal KDEL añadido en el extremo carboxilo-terminal. La proteína de fusión puede producirse en gran cantidad en E. coli. Cuando se inmunizan cerdos con la proteína de fusión, es posible reducir o eliminar la viremia tras exponerse a VSRRP en los cerdos inmunizados. El texto completo de la patente se incorpora al presente documento.

En la heterodimerización entre ORF5 y ORF6 del VSRRP, el epítopo Cys-34 de ORF5 y el epítopo Cys-8 de ORF6 desempeñan un papel crítico en la infección viral y el ensamblaje de la envuelta del mismo. (Snijder Eric J., Jessica C. et al., Journal of Virology, enero de 2003, vol. 77, n.º 1:97-104) . Además, la secuencia consenso de ORF5 del VSRRP (YKNTHLDLIYNA) es un epítopo entre el aminoácido 38 y el aminoácido 44, que está ubicado en el dominio extracelular N-terminal de ORF5 del VSRRP y se ha identificado como un epítopo de neutralización (Ostrowski M., J.

A. Galeota, et al., Journal of Virology, mayo de 2002, vol. 76, n.º 9:4241-4250) .

La técnica anterior da a conocer la construcción de antígenos de ORF5 u ORF6 del VSRRP completos entre PE y KDEL. Tras la inmunización de estas proteínas de fusión, los cerdos padecieron una inflamación intensa en sus pulmones tras exponerse al VSRRP, lo que indica que ORF5 u ORF6 del VSRRP tiene un efecto alérgico específico de antígeno. De manera manifiesta, es difícil usarlos como antígenos de vacuna contra el SRRP. Por tanto, para desarrollar una vacuna y proteger de manera eficaz los cerdos frente a infecciones por SRRP, existen un gran número de dificultades que deben superarse. Debería diseñarse para que tenga una menor inmunotoxicidad y un mayor título de neutralización.

La publicación de patente estadounidense n.º 2004/0247617 da a conocer medios para la vacunación contra el VSRRP usando una proteína de fusión que comprende a) un dominio de translocación de exotoxinas A de Pseudomonas, b) un péptido expresado a partir de ORF7 del VSRRP, y c) una secuencia peptídica carboxiterminal que comprende KKDELRDELKDEL. El elemento a) se usa con el fin de translocar la proteína de fusión al citoplasma celular tras la unión celular, y el elemento c) se usa con el fin de retener la proteína en el retículo endoplásmico. En estudios de inmunización (ejemplo 2) se usaron dos proteínas, una que tenía el extremo C-terminal de tipo KDEL (“PE-DGDK”) y una sin el mismo (“PE-DGD”) . La mejor protección frente a la exposición viral se obtuvo con la proteína de fusión de tipo PE-DGDK.

Sumario de la invención En un aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) , que comprende: a) un péptido de exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende un dominio de unión y un dominio de translocación, ubicado en el extremo N-terminal de la proteína de fusión; b) un péptido de fusión de ORF6-2!26 (SEQ ID NO: 11) y ORF5-31-63 (SEQ ID NO: 10) de la cepa americana de VSRRP, o un péptido de fusión de ORF6-M1-I28 (SEQ ID NO: 12) y ORF5-F31!A64 (SEQ ID NO: 13) de la cepa europea de VSRRP; y c) un dominio carboxilo-terminal que comprende la secuencia de aminoácidos de KDEL-KDEL-KDEL

ubicado en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en el que las letras mayúsculas “KDEL” representan códigos de aminoácido de una sola letra.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de una proteína de fusión tal como se mencionó anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión tal como se mencionó anteriormente para su uso en la prevención del VSRRP.

Además en otro aspecto, la invención se refiere a una composición de vacuna tal como se mencionó anteriormente para su uso en la prevención del VSRRP.

En la presente invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión que contiene un fragmento de ORF5 del VSRRP y un fragmento de ORF6 del VSRRP puede modificarse, y no existe limitación particular para la secuencia, pero es preferiblemente una secuencia de ácido nucleico que puede expresarse en grandes cantidades en un sistema huésped-vector de E. coli, y las proteínas expresadas son idénticas a las de tipo natural. Tomando como ejemplo la cepa americana del VSRRP, preferiblemente la secuencia de ácido nucleico modificada que codifica para la proteína de fusión es tal como se observa en SEQ ID NO:1. Para las cepas europeas del VSRRP, preferiblemente la secuencia de ácido nucleico modificada que codifica para la proteína de fusión es SEQ ID NO:9.

Una realización preferida del fragmento del dominio de unión y de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas de la proteína de fusión en la presente invención es una exotoxina de Pseudomonas a la que se le ha eliminado la toxicidad, que es un fragmento de la exotoxina A de Pseudomonas sin dominio III. Preferiblemente, el fragmento de dominio de unión y de translocación de la exotoxina A de Pseudomonas actúa como resto ligando que puede reaccionar con, reconocer o unirse a un receptor en la célula diana.

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender un adyuvante adecuado conocido en la técnica: dispersante, humectante (tal como Tween 80) , o inyecciones estériles preparadas con suspensiones (tal como disoluciones para inyección estéril o disoluciones en aceite) . Las preparaciones para inyección estéril también pueden usarse en diluyentes o disolventes de suspensiones o inyecciones estériles durante inyecciones inocuas, por ejemplo, en disoluciones de 1, 3-butanodiol. Los disolventes o vehículos aceptables incluyen manitol, agua, solución de Ringer y disolución isotónica de cloruro de sodio. Además, en la técnica anterior se usan aceites esterilizados y fijos como disolventes o medios de suspensión (por ejemplo, monoglicéricos o diglicéridos sintetizados) . Los ácidos grasos (tales como ácidos oleicos o derivados de glicéridos) y aceites naturales farmacéuticamente aceptables (tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente derivados polioxietilados de los mismos) pueden usarse en preparaciones inyectables. Las suspensiones o disoluciones en aceite también pueden comprender dispersantes,... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) , que comprende:

a) un péptido de exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende un dominio de unión y un dominio de translocación, ubicado en el extremo N-terminal de la proteína de fusión;

b) un péptido de fusión de ORF6-2!26 (SEQ ID NO: 11) y ORF5-31-63 (SEQ ID NO: 10) de la cepa americana de VSRRP, o un péptido de fusión de ORF6-M1-I28 (SEQ ID NO: 12) y ORF5-F31!A64 (SEQ ID NO: 13) de la cepa europea de VSRRP; y c) un dominio carboxilo-terminal que comprende la secuencia de aminoácidos de KDEL-KDEL-KDEL ubicada en el extremo C-terminal de la proteína de fusión, en el que las letras mayúsculas “KDEL”

representan códigos de aminoácido de una sola letra.

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende un epítopo que puede inducir títulos de neutralización.

3. Composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de una proteína de fusión según la reivindicación 1 ó 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Proteína de fusión según la reivindicación 1 ó 2, para su uso en la prevención del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) .

5. Composición de vacuna según la reivindicación 3, para su uso en la prevención del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (VSRRP) .

6. Proteína de fusión según la reivindicación 1, que comprende el péptido de fusión de

20 GSSLDDFCYDSTAPQKVLLAFSITYASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFDWA, en el que las letras mayúsculas representan códigos de aminoácido de una sola letra.

7. Proteína de fusión según la reivindicación 1, que comprende el péptido de fusión de MGSLDDFCNDSTAAQKLVLAFSITYTPIFVAGGSSSTYQYIYNLTICELNGTDWLSNHFDWA, en el que las letras mayúsculas representan códigos de aminoácido de una sola letra.

8. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que ORF5-31-63 está ubicado entre ORF6-2!26 y el dominio carboxilo, y ORF5-F31!A64 está ubicado entre ORF6-M1-I28 y el dominio carboxilo.